《母豬卵巢早衰相關miR-148a功能鑑定與分子調控機制研究》是依託華南農業大學，由張愛玲擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：母豬卵巢早衰相關miR-148a功能鑑定與分子調控機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：張愛玲
- 依託單位：華南農業大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
卵巢原始卵泡的靜止、儲備和數量決定了哺乳動物繁殖年限的長度。原始卵泡受到過早激活，引起卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），導致母豬繁殖年限下降，增加養殖成本。前期生物信息學預測及實驗表明，在POF卵巢與青春期前母豬卵巢差異表達miR-148a與POF密切相關。在此基礎上，首先通過原位雜交和RT-PCR檢測miR-148a時空表達規律；然後通過超表達和抑制表達，在細胞或者組織水平，鑑定miR-148a生物學功能；通過Western blot、Sensor-report載體構建驗證miR-148a靶基因，並深入分析靶基因潛在信號調控網路。研究結果將為闡明母豬POF分子機制積累重要資料；為母豬早期選育和繁殖性能的標記輔助選擇和早期選育提供遺傳學依據，對降低生產成本具有潛在的重要意義；對於研究生殖相關miRNA調控途徑及人類POF具有借鑑意義。
結題摘要
前期發現miR-148a、miR-196b-5p、miR-34c可能與母豬卵泡儲備激活相關，為母豬POF的候選miRNA。通過qRT-PCR、細胞培養、超表達和抑制表達、Western-blotting等技術，研究3個miRNA與卵巢功能，獲得如下結果： （1）成功培養豬卵巢顆粒細胞。顆粒細胞經FSHR免疫螢光鑑定為陽性，且純度高，培養48 h時，處於S期的細胞比例最高，占36.73%；在培養的1～4天為對數生長期，細胞活力高，可以用於後續試驗。 （2）miR-148a影響豬卵巢顆粒細胞功能及靶基因驗證：超表達miR-148a後，採用CyQUANT Cell Proliferation Assay法和Annexin V/PI法檢測miR-148a在24 h到36 h之間促進可促進細胞的增殖，隨著轉染時間延長，豬顆粒細胞開始凋亡；干擾miR-148a後，細胞凋亡不明顯。Sensor-report實驗驗證miR-148a靶基因為ESR1。 （3）miR-196b-5p功能研究 在分子水平，miR-196b-5p負調控靶基因p27和BCL11A；miR-196b-5p啟動子受轉錄因子PPARg的正調控和p65的負調控。在細胞水平，miR-196b-5p通過靶基因p27及其下游的細胞周期蛋白和激酶CDK1、CDK2、cyclin A、cyclin B1和凋亡蛋白酶Caspase-3實現對細胞周期和原始卵泡的調控。在組織水平，卵巢中miR-196b-5p內平衡的破壞，導致新生小鼠原始卵泡的閉鎖和耗竭；導致2月齡小豬卵巢原始卵泡的激活，可能是發育卵泡缺乏卵丘-卵母細胞複合物結構而引發卵泡閉鎖。 （4）miR-34c的功能研究 在分子水平，miR-34c負調控靶基因FoxO3a；miR-34c啟動子受P53、P50/P65正/負調控。在細胞水平，miR-34c促進顆粒細胞凋亡及細胞凋亡基因Bax/Bcl和Caspase-3的表達，抑制顆粒細胞增殖及細胞增殖基因PCNA的表達；FoxO3a能夠抑制顆粒細胞凋亡並抑制顆粒細胞增殖，與miR-34c調控顆粒細胞表型相反；FoxO3a能夠回復miR-34c引起的功能變化。 上述結果為深入研究miRNA通過調控顆粒細胞功能進而調節原始卵泡儲備與激活與積累了重要的資料，對於揭示人類卵巢早衰分子調控機制具有很好的借鑑意義。
