《檸檬酸對羅倫隱球酵母細胞生活力喪失機理的研究》是依託北京工商大學，由王友升擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：檸檬酸對羅倫隱球酵母細胞生活力喪失機理的研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：王友升
- 依託單位：北京工商大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
拮抗酵母菌主要通過在果蔬傷口處與病原菌進行營養與空間競爭來防治采後病害，其產業化的關鍵在於最大限度保持菌劑的生活力。本項目針對前期研究中發現檸檬酸可誘導羅倫隱球酵母細胞生活力喪失的現象，擬從逆向思維的角度出發，在利用螢光標記技術明確檸檬酸誘導羅倫隱球酵母細胞死亡類型的基礎上，採用代謝組學技術確定檸檬酸誘導羅倫隱球酵母生活力喪失過程中胞內代謝指紋與胞外代謝足跡圖譜，並利用表型晶片技術分析檸檬酸對酵母細胞的碳、氮、磷、硫的代謝、小分子與大分子生物合成的影響，對酵母耐受外界滲透壓、離子強度與酸度的影響，以及對細胞表面結構與運轉功能、細胞呼吸、細胞應力和修復功能的影響，確定檸檬酸所誘導的羅倫隱球酵母細胞表型指紋圖譜。通過特徵代謝產物指紋/足跡圖譜與細胞表型指紋圖譜的相互印證，以闡明檸檬酸誘導羅倫隱球酵母細胞生活力喪失的機理，為篩選拮抗酵母菌生活力的保護劑提供新的思路和理論依據。
結題摘要
拮抗酵母菌主要通過在果蔬傷口處與病原菌進行營養與空間競爭來防治采後病害，其產業化的關鍵在於最大限度保持菌劑的生活力。本項目針對前期研究中發現檸檬酸可誘導羅倫隱球酵母細胞生活力喪失的現象，從逆向思維的角度出發，解決三個關鍵科學問題，闡明了檸檬酸誘導羅倫隱球酵母細胞生活力喪失的機理：（1）確定檸檬酸誘導羅倫隱球酵母生活力喪失過程中存在細胞凋亡，即細胞主動死亡的現象。利用磷脂結合蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸螢光素（FITC）螢光探針檢測，確定檸檬酸鈉誘導拮抗酵母菌C. laurentii生活力喪失過程中，存在位於質膜內側小頁的磷脂醯絲氨酸遷移至質膜外側小頁的現象；利用脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL），確定拮抗酵母菌C. laurentii細胞因凋亡而出現了染色質凝集、片段化。在確定檸檬酸鈉誘導C. laurentii細胞凋亡具有菌株特異性的基礎上，進一步利用表型晶片技術確定C. laurentii細胞凋亡現象的產生與其碳源代謝指紋圖譜存在一定的相關性。（2）揭示檸檬酸誘導羅倫隱球酵母細胞生活力喪失的特徵代謝物質及其生物學意義。通過比較不同色譜柱對37種脂肪酸的分離性能構建檢測脂肪酸的方法，並解析了羅倫隱球酵母細胞內脂肪酸指紋圖譜的變化規律。利用雷射掃描共聚焦顯微鏡和流式細胞術，發現在檸檬酸鈉誘導拮抗酵母細胞生活力快速喪失過程中活性氧（ROS）產生高峰遠早於酵母細胞凋亡早期特徵的發生高峰，添加外源GSH確定ROS在調控酵母細胞凋亡中發揮重要作用。通過GC-MS進行胞外代謝產物的測定以及構建的擬穩態模型，發現檸檬酸鈉僅作為外源誘導因素來影響整體代謝網路的通量水平。（3）確定檸檬酸作為外源信號分子發揮作用並解析其生物學意義。利用表型晶片技術進一步揭示影響檸檬酸鈉對C. laurentii生活力影響的促進/拮抗營養因子，確定檸檬酸鈉作為外源信號調控羅倫隱球酵母細胞生活力，受檸檬酸鈉的濃度、酸度、離子組成和YNB中的營養因子。利用代謝組學手段解析果實采後衰老期間糖、酸、胺基酸等非揮發性風味物質的變化規律，利用表型晶片技術解析李果實采後病原菌的生物學特徵，尤其是碳源代謝指紋圖譜的菌株特異性，闡明拮抗酵母菌-病原菌-果實之間互作的物質基礎。本研究闡明了檸檬酸誘導羅倫隱球酵母細胞生活力喪失的機理，為篩選拮抗酵母菌生活力的保護劑提供新的思路和理論依據。
