檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法:專利背景,發明內容,專利目的,技術方案

《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》是華中農業大學於2006年12月30日申請的專利，該專利的公布號為CN1995332，授權公布日為2007年7月11日，發明人是郭愛珍、張書環、陳煥春、譚亞娣、晁彥傑、陳穎鈺、欽博、呂文、匡有吉。

《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》屬於動物細菌學與動物傳染病學技術領域。具體涉及一種檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及其製備方法。該發明的試紙條是由樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯組裝而成。在PVC背襯上按順序依次粘附有樣品墊、結合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊；所述的結合墊上包被有MPB83蛋白－膠體金標記物；所述的硝酸纖維素膜上分別包被有由純化的MPB70蛋白構成的檢測線和由純化的兔抗MPB83蛋白IgG構成的質控線。該發明還公開了牛分枝桿菌特異性抗原MPB83的製備。用於試紙條的特異性抗原之一的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET28a－MPB83保藏在CCTCC，保藏編號：CCTCC NO：M206142。該發明的試紙條具有特異性強，靈敏度高，可套用於牛結核抗體的檢測。

2020年7月14日，《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》獲得第二十一屆中國專利獎優秀獎。

基本介紹

中文名：檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法
申請人：華中農業大學
申請日：2006年12月30日
申請號：2006101665510
公布號：CN1995332
公布日：2007年7月11日
發明人：郭愛珍、張書環、陳煥春、譚亞娣、晁彥傑、陳穎鈺、欽博、呂文、匡有吉
地址：湖北省武漢市洪山區獅子山街1號
Int. Cl.：C12N1/21(2006.01)、C12N15/31(2006.01)、G01N33/544(2006.01)、G01N33/532(2006.01)、C12R1/19(2006.01)
代理機構：武漢宇晨專利事務所
代理人：王敏鋒
類別：發明專利

專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,

專利背景

牛結核病是一種嚴重危害奶牛業的人獸共患傳染病，由牛分枝桿菌感染所致。被國際動物衛生組織（OIE）定為B類動物傳染病。牛結核給世界農業造成的損失大於牛的其他各種疾病的損失總和，每年超過30億美元。牛分枝桿菌不但可以感染牛及其它多種哺乳動物，而且可感染人。中國內外的人結核病原學調查均發現，牛分枝桿菌是人結核的重要病因之一。因此，世界衛生組織專家委員會第七次會議報告指出：除非消滅牛結核，否則人類結核病的控制是不會成功的（王忠仁.牛結核病與人結核病的相互關係.中國防癆雜誌，2005，27（5）：123-125）。

由於2006年前為止尚未發現有效藥物與疫苗用於牛結核病的防治，根除牛結核病主要採取檢疫與撲殺陽性牛的國際通用政策。結核菌素（purified protein derivatives，PPD）又稱為純化蛋白衍生物，是結核分枝桿菌在液體培養基中生長時產生的代謝物質，含有多種抗原成分，用於檢測結核病時敏感性較高。因此，結核菌素皮內變態反應是國際動物衛生組織與中國認可的法定檢疫方法。但由於結核菌素可能包含有與其它分枝桿菌相同的非特異性抗原組份，檢測時容易出現假陽性；結核菌素皮內變態反應對感染後期的開放性結核及全身性結核不敏感，而此階段正是結核患者傳播疾病的危險時期。以上原因使結核菌素皮內變態反應的特異性受到質疑。此外，結核菌素皮內變態反應只能進行活體試驗，而不能對保存的樣品進行回顧性分析，更不適用於野生動物和邊遠山區的牛結核病普查。

針對2006年前中國內外普遍採用的牛結核病診斷方法——結核菌素皮內變態反應的缺陷，該申請人的農業微生物國家重點實驗室動物病原分室研製出了一種用間接血凝方法檢測牛結核抗體的試劑盒（專利申請號：200510019996.1）。鑒於當時的技術，該試劑盒還有下列一些需要改進的地方，如該試劑盒中只用到MPB70單一抗原，檢測的敏感度有待進一步提高；所用的1％致敏綿羊紅細胞在4℃下保存期只有半年。

Greenwald證明MPB83和MPB70是牛分枝桿菌主要的特異性分泌抗原（Greenwald R，Esfandiari J，Lesellier S et al.Improved serodetection of Mycobacterium bovis infection in badgers（Meles meles）using multiantigen test formats.Diag Microbiol Infect Dis，2003，46：197-203.）。MPB83是一種菌體表面相關脂蛋白，在體內不僅引發細胞免疫，而且引發體液免疫，具有免疫原性和免疫保護（Feng C G，Palendira U C，Demangel J M，et al.Priming by DNA immunizationaugments protective efficacy of Mycobacterium bovis bacille calmette-guerin againsttuberculosis[J].Infect Immun，2001，69：4174-4176.）。MPB83是早期分泌靶蛋白（O′Loan CJ，Pollock JM，Hanna J，Neill SD.Immunoblot analysis of humoral immune responses toMycobacterium bovis in experimentally infected cattle：early recognition of a 26-kilodaltonantigen[J].Clin Diag Lab Immunol，1994，1：608-611.），可被疾病早期的人和動物免疫系統識別，因而對結核病的早期診斷具有重要意義。

MPB70是牛分枝桿菌特異性分泌蛋白質，分泌量占毒力牛分枝桿菌培養基蛋白總量的10％，是牛分枝桿菌感染過程中重要的體液和細胞免疫目標抗原（Harboe M，Nagai S.MPB70，a unique antigen of Mycobacterium bovis BCG[J].Am Rev Resp Dis.1984，129：444-452），也是PPD的主要成分之一。在牛分枝桿菌中成熟的MPB70蛋白很穩定，是理想的檢測抗原（MarkD.Carr，Marieke J.Bloemink，Ellen Dentten et al.Solution Structure of the Mycobacteriumtuberculosis Complex Protein MPB70[J].Biological Chemistry.2003，278（44）：43736-43743.）。

MPB83與MPB70有61％同一性的同源蛋白質（Nagai S，Matsumoto J，Nagasuga T.Specificskin-reactive protein from culture filtrate of Mycobacterium bovis BCG [J].InfectImmun.1981，31（3）：1152-1160.），本研究室分別用酶聯免疫吸附法（ELISA）和瓊脂擴散法證明了MPB70能與MPB83的抗血清反應，而MPB83也能與MPB70的抗血清反應，這說明MPB70與MPB83具有共同的抗原決定族。

膠體金免疫層析（gold-immunochromatography assay GICA）是20世紀80年代發展起來的一項新的免疫分析方法，是套用膠體金標記技術，以膠體金作為示蹤物，套用於抗原抗體反應的一種新型免疫標記技術。它具有簡便，快速，特異性強，靈敏度高，費用低的優點。

2006年前，將膠體金免疫層析技術套用於體外檢測牛結核病抗體在中國仍屬空白，國外商品化的試劑盒只有韓國Animal Genetics，Inc公司生產的“Anigen Rapid Bovine TB Ab TestKit”，該試劑盒是將MPB70蛋白作為檢測抗原，特異性很好，但敏感性不高，會在臨床上出現漏檢。該申請人研發的“檢測牛結核病抗體的免疫膠體金試紙條”同時套用MPB70和MPB83兩個蛋白作為檢測抗原在中國內外尚屬首例，具有高特異性和高敏感性。

發明內容

專利目的

《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》目的在於提供一種特異性強、靈敏度高，抗原蛋白便於貯存和攜帶的檢測牛結核病的抗體的免疫膠體金試紙條及其製備方法，為中國牛結核病防制提供一種簡便的檢測和診斷方法及工具。

技術方案

為了實現《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》，申請人構建了一種能分泌牛結核分枝桿菌抗原MPB83的重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET28a-mpb83，該菌株於2006年12月21日保藏在中國典型培養物保藏中心（CCTCC），其保藏號為CCTCC NO：M206142。利用該重組菌株分泌的MPB83作為膠體金標記抗原。

《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》所用到的另一個能分泌牛結核分枝桿菌抗原MPB70的重組大腸桿菌EscherichiacoliBL21/pET28a-mpb70，保藏編號為CCTCC NO：M205135，利用該重組菌株分泌的MPB70作為檢測線的包被抗原。

如附圖2所示，《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條，它包括樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4）和PVC背襯（7），其具體結構是：在PVC背襯（7）上按順序依次粘附有樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4）；所述的結合墊（2）上包被有MPB83蛋白—膠體金標記物；所述的硝酸纖維素膜（3）上分別包被有由純化的MPB70蛋白構成的檢測線（5）和由純化的兔抗MPB83蛋白IgG構成的質控線（6）。上述材料除抗原和抗體以外，均購自Millipore公司。

製備上述檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條的方法，其步驟包括：

1）克隆牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83，轉化大腸桿菌，得到保藏編號為CCTCCNO：M206142的重組大腸桿菌並使其表達；

2）將步驟1）所述的MPB83蛋白和保藏編號為CCTCC NO：M205135的MPB70蛋白進行純化；

3）將步驟2）製備的MPB83蛋白免疫健康家兔，得到兔抗MPB83IgG抗體；

4）用檸檬酸三鈉與氯金酸反應製備膠體金；

5）將步驟2）製備的MPB83蛋白加入步驟4）製備的膠體金中，得到MPB83蛋白—膠體金標記物；

6）將步驟5）製備的MPB83蛋白—膠體金標記物包被在結合墊（2）上；

7）將步驟2）製備的MPB70蛋白包被在硝酸纖維素膜（3）上構成檢測線（5）；並將步驟2）製備的兔抗MPB83蛋白的IgG包被在硝酸纖維素膜（3）上構成質控線（6）；

8）在所述的PVC背襯（7）上按順序依次粘附所述的樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4），得到所述的檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條。

《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》克隆了牛分枝桿菌特異性抗原MPB83的編碼基因，構建了原核表達載體，使其在大腸桿菌中表達，對MPB83蛋白進行純化，備用。同時對MPB70蛋白也進行純化，備用。選用提純的MPB70作為檢測線的包被抗原，用提純的MPB83作為膠體金標記抗原，利用雙抗原夾心來檢測待測樣品（血清）中的相應抗體，根據檢測線條帶顏色深淺或有無來判斷待測樣品液中是否含有MPB83和MPB70抗原的抗體。如果質控線上沒有紅色條帶出現，則該試紙條失效（使用方法具體參見實施例）。

改善效果

1、《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條同時用到兩個牛結核分枝桿菌分泌的抗原蛋白即MPB83和MPB70，因此既具有高特異性又具有高敏感性。

2、《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的檢測試紙條檢測時間短（20分鐘）且不需要任何特殊儀器、設備，檢測成本低。

3、《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的檢測試紙條操作簡便，不需由專業人員操作。

4、《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的檢測試紙條儲存方便，對溫度要求不高，在4～8℃下有效保存期可達兩年；在室溫下可保存12個月。

附圖說明

圖1：《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的總體技術路線圖

圖2：《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》檢測試紙條的組裝示意圖

圖中：1為樣品墊，2為結合墊，3為硝酸纖維素膜，4為吸收墊，5為檢測線，6為質控線，7為PVC背襯

圖3：《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》檢測試紙條結果判定示意圖

圖中：A：為陽性標準品結果，B：為陽性樣品結果，C：為陰性樣品結果，D、E：為試紙條失效。

圖4：是《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的載體構建物理圖。

圖5：mpb83基因PCR擴增結果。

圖中：1，2，3：擴增出的目的基因；M：DL2000的分子量標準

圖6：重組質粒pET28a-mpb83酶切鑑定結果

圖中：M1：DL15000的分子量標準（由上到下依次為15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp）；M2：DL2000的分子量標準（由上到下依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp）；p：BL21/pET28a（+）；rp：BL21/pET28a-mpb83

註：編號1-4為來自不同單菌落的轉化子；2號為酶切後鑑定正確的重組質粒圖7：是《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》誘導表達的牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83的SDS-PAGE電泳圖，圖7顯示在不同IPTG誘導濃度和誘導時間下MPB83蛋白表達情況

圖8：純化的MPB83蛋白的SDS聚丙烯醯胺凝膠變性電泳圖圖中：M：蛋白質分子量標準；1，2：提純的MPB83蛋白

圖9：純化的MPB83蛋白的Western blot分析圖

圖中：M：蛋白質分子量標準；1：純化的MPB83蛋白與牛結核病陰性血清作用；2：純化的MPB83蛋白與牛結核病陽性血清作用

圖10：純化的兔抗MPB83蛋白IgG的SDS聚丙烯醯胺凝膠變性電泳圖圖中：M：蛋白質分子量標準；1，2：提純的MPB83蛋白IgG

技術領域

《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》涉及動物細菌學與動物傳染病學技術領域。具體涉及一種檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及其製備方法。

權利要求

1、包含由保藏號為CCTCC M206142的重組大腸桿菌（Escherichia coli）BL21/pET28a-mpb83所分泌的牛結核分枝桿菌抗原蛋白MPB83和重組牛結核分枝桿菌抗原蛋白MPB70的牛結核抗體免疫膠體金試紙條。

2、權利要求1所述的牛結核抗體免疫膠體金試紙條，其包括樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4）和PVC背襯（7），其特徵在於，在PVC背襯（7）上按順序依次粘附有樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4）；所述的結合墊（2）上包被有MPB83蛋白—膠體金標記物；所述的硝酸纖維素膜（3）上分別包被有純化的MPB70蛋白構成的檢測線（5）和純化的兔抗MPB83蛋白的IgG構成的質控線（6）。

3、權利要求1或2所述的牛結核抗體免疫膠體金試紙條的製備方法，其步驟包括：

1）分別克隆牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83和MPB70，轉化大腸桿菌，得到相應的重組大腸桿菌；

2）由步驟1）所述的重組大腸桿菌分別製備牛結核分枝桿菌抗原蛋白MPB83和MPB70；

3）對步驟2）所述的抗原蛋白進行純化；

4）用步驟2）製備的MPB83蛋白得到兔抗MPB83IgG抗體；

5）用檸檬酸三鈉與氯金酸反應製備膠體金；

6）將步驟3）製備的抗原蛋白MPB83加入步驟5）的膠體金中，得到MPB83蛋白—膠體金標記物；

7）將步驟6）製備的MPB83蛋白—膠體金標記物包被在結合墊（2）上；

8）將步驟3）製備的MPB70蛋白包被在硝酸纖維素膜（3）上構成檢測線（5）；並將步驟4）製備的兔抗MPB83 IgG包被在硝酸纖維素膜（3）上構成質控線（6）；

9）在所述的PVC背襯（7）上按順序依次粘附所述的樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4），得到所述的檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條。

實施方式

實施例1（製備實施例）

（一）牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83基因的克隆及其在重組大腸桿菌中的表達和純化1牛型分枝桿菌特異性抗原基因mpb83 cDNA序列的克隆

（1）PCR引物設計與合成

根據Genbank中mpb83基因序列（登錄號：GI：31794050）設計上下游引物。上游引物引入EcoRI酶切位點（如引物中的下劃線所示），設計6個保護鹼基，下游引物引入HindIII酶切位點（如引物中的下劃線所示），設計6個保護鹼基。《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的引物由北京奧科生物公司合成。

mpb83上游引物：5’-AGTTCAGAATTCATGATCAACGTTCAGGCCAAAC-3’

mpb83下游引物：5’-ACGTCGAAGCTTTTACTGTGCCGGGGGCATCA-3’

（2）MPB83蛋白質編碼基因擴增與處理

將牛型分枝桿菌標準株（（Mycobacterium bovis AF2122/97，該菌株由湖北出入境檢驗檢疫局郭明星研究員惠贈，其基因序列已經在Genebank登錄，登錄號為：NC002945）細菌培養物加少量雙蒸水煮沸10分鐘裂解菌體，離心後取上清液作為PCR模板。PCR擴增反應體系為：10×Taq Buffer5.0微升，25毫摩爾/升MgCl₂ 1.0微升，2毫摩爾/升 dNTPs 1.5微升，20微摩爾/升上、下游引物各1.0微升，TaqDNA聚合酶1.0微升，模板3微升，無菌雙蒸水加至50微升。PCR反應條件：94℃變性4分鐘，進入30個循環（94℃變性30sec，60復性30sec，72℃延伸2分鐘），最後72℃延伸10分鐘。擴增的PCR產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析，一條大小660bp的mpb83基因片段（如附圖5）。使用DNA凝膠快速回收試劑盒（購自上海生物工程公司）純化mpb83基因片段。

2牛型分枝桿菌特異性抗原基因mpb83原核表達載體的構建

（1）重組大腸桿菌Escherichia coli DH5α/pET28a-mpb83的構建

將PCR產物進行回收，純化後，與克隆載體pMD18-T（一個商業質粒載體，購買自大連寶生物有限公司）連線，轉化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆子，小量提取質粒，用限制內切酶對重組質粒進行酶切鑑定，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳，證實其大小與預期符合；經測序證實該片段無鹼基誤配。

用EcoRI和HindIII雙酶切pET28a（+）（購自invitrogen公司）和PCR產物，用DNA凝膠快速回收試劑盒（購自上海生物工程公司）純化回收，然後用T41igase連線進行粘末端連線，16℃水浴過夜，轉化DH5α感受態細菌，37℃培養，挑菌，提取重組質粒，酶切鑑定（如附圖6）。該重組表達質粒被命名為pET28a-mpb83。

3重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET28a-mpb83的構建（如附圖4）

將序列鑑定正確的重組表達載體pET28a-mpb83轉化至大腸桿菌BL21（大腸桿菌菌株購自Stratagene公司）感受態細胞，塗布LB卡那黴素（至終濃度為50微克/毫升）平皿，挑選平皿上單個陽性菌落（BL21/pET28a-mpb83），接入LB液體培養基中37℃振盪培養至對數生長期（OD₆₀₀＝0.6-0.8），向培養基中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）誘導表達，然後進行SDS聚丙烯醯胺凝膠變性電泳和Western-blot檢測（薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編，分子克隆實驗指南，金冬雁，黎孟楓等譯，第二版，科學出版社，北京，1992版），同時將原載體pET28a同步轉化至大腸桿菌BL21（DE3）細胞，作為空白對照菌（BL21/pET-28a）。

3牛型分枝桿菌特異性抗原蛋白MPB83的原核誘導表達

（1）最佳誘導物濃度及最佳誘導時間的確定

挑取單個重組大腸桿菌Escherichia coli BL21/pET28a-mpb83菌落至5毫升 LB培養基，加卡那黴素至終濃度為50微克/毫升，37℃搖床培養8小時後放4℃冰櫃過夜。用含50微克/毫升卡那黴素的LB培養基將該菌液按1:100比例稀釋後，分裝至2支細菌培養瓶中（10毫升/瓶），置37℃搖床培養至對數生長期（OD600＝0.6-0.8），加入誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至終濃度分別為0.4、0.8摩爾/升，分別在誘導後第0、1、2、3、4小時取1毫升細菌培養物，12000轉/分離心收集菌體，PBS漂洗沉澱並用50微升重懸，加入40微升2×SDS上樣緩衝液和10微升 DTT，100℃煮沸10分鐘，取20微升進行SDS聚丙烯醯胺凝膠變性電泳分析（如附圖7）（薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編，《分子克隆實驗指南》，第二版，北京科學出版社，1992版）。根據MPB83蛋白表達情況確定IPTG最佳誘導濃度為0.8毫摩爾/升，最佳誘導時間為3小時。

（2）牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83的大量誘導表達和蛋白純化

從平皿上挑取單個菌落至5毫升 LB培養基，卡那黴素（Kan）至終濃度為50微克/毫升，37℃搖床培養至混濁（約8小時），放4℃冰櫃過夜。取該菌液2毫升加入200毫升LB/Kan培養基中，置37℃搖床培養約3小時至OD600＝0.6-0.8，加入誘導劑IPTG至終濃度為0.8毫摩爾/升，繼續誘導培養3小時。

誘導的菌體經離心、超音波破碎後提取包涵體，經純化、變性、復性和透析等處理後分裝於-20℃保存備用。參照薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主編，《分子克隆實驗指南》，第二版，北京科學出版社，1992版報導的方法對純化的蛋白（如附圖8所示）進行westernblot分析，結果如附圖9，證實該重組大腸桿菌可以特異性地表達牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83，表達的蛋白以包涵體的形式存在大腸桿菌BL21中，且具有免疫學活性。

（二）兔抗MPB83蛋白IgG的製備與提純

將純化的MPB83蛋白免疫健康家兔，製備高特異性、高效價的兔抗MPB83蛋白高免血清，將含有MPB83抗體的兔血清4000轉/分離心10分鐘取上清按以下步驟提純：取10毫升上清於4℃，12000轉/分離心10分鐘，棄雜質，然後加入40毫升0.06M pH4.5的醋酸鹽緩衝液，再在室溫（25℃）下緩慢加入330微升辛酸，邊滴加邊攪拌。緩慢加入飽和硫酸銨至終濃度為45％，用0.01M PBS（pH7.4）溶解後透析過夜。SDS聚丙烯醯胺凝膠變性電泳分析（如附圖10）顯示有兩條蛋白帶，一條為IgG重鏈，一條為IgG輕鏈。用紫外分光光度計測定純化多抗在280納米和260納米波長時的光吸收值（OD），按公式1.45×OD280-0.74×OD260計算多抗濃度。調整溶液體積，使其終濃度為10毫克/毫升。利用該抗體包被硝酸纖維素膜上的質控線。

（三）牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB70基因的克隆及其在重組大腸桿菌中的表達和純化

牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB70基因的克隆及其在重組大腸桿菌中的表達和純化的方法步驟參見專利申請號為200510019996.1，發明名稱為“一種適用於牛結核抗體檢測的試劑盒及套用”說明書所公布的內容。

實施例2（製備實施例）

牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83和MPB70抗體診斷試劑盒組裝及製備方法

1、試劑盒組裝：

《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》的試劑盒組成如下：樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4）和PVC背襯（7），具體結構和裝配順序是：在PVC背襯（7）上按順序依次粘附有樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4）；所述的結合墊（2）上包被有MPB83蛋白—膠體金標記物；所述的硝酸纖維素膜（3）上分別包被有純化的MPB70蛋白構成的檢測線（5）和純化的兔抗MPB83蛋白IgG構成的質控線（6）。

2膠體金的製備：

用超純水將1％氯金酸稀釋成0.01％，置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，按每100毫升 0.01％氯金酸加入2.0毫升 1％檸檬酸三鈉，繼續煮沸，直到液體呈橙紅色即停止加熱，冷卻至室溫後補足失水。製備好的膠體金外觀應純淨、透亮、無沉澱和漂浮物，有效期一年。

3MPB83蛋白-膠體金標記物製備：

磁力攪拌下，用0.1M碳酸鉀調膠體金的pH值至6.5，按每毫升膠體金加入2微升 500微克/毫升MPB83蛋白，繼續攪拌混勻30分鐘，加入10％BSA至終濃度為1％，靜置30分鐘。12000rpm、4℃離心30分鐘，棄上清，沉澱用0.02M pH9.0的硼酸鹽緩衝液（配方：硼酸0.1237克，PEG-200001克，用超純水定容至1000毫升，調pH至9.0）洗滌兩次，用二十分之一初始膠體金體積的0.02MpH9.0的硼酸鹽緩衝液（配方：硼酸0.1237克，PEG-200001克，用超純水定容至1000毫升，調pH至9.0）將沉澱重懸，置4℃備用，有效期60天。

4結合墊的包被

將結合墊浸泡於0.01M pH 7.4磷酸緩衝液（配方及製備：20克 BSA，25克蔗糖，3克聚乙烯基吡咯烷酮（PVP-10），0.2克NaN₃NaCl 8克，KCl 0.2克，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9克，KH₂PO₄ 0.2克，用超純水定容至1000毫升）中30分鐘後，於37℃烘乾。然後用Biodot點膜儀將製備好的MPB83蛋白-膠體金標記物均勻包被在結合墊上，每厘米結合墊包被9微升MPB83蛋白-膠體金標記物，真空乾燥，真空封裝，置4℃備用。

5樣品墊的處理

將樣品墊浸泡於0.01M pH 7.4磷酸緩衝液（配方及製備：20克牛血清白蛋白（BSA），25克蔗糖，3克PVP-10，0.2克NaN₃，NaCl 8克，KCl 0.2克，Na₂HPO₄·12H₂O 2.9克，KH₂PO₄0.2克，用超純水定容至1000毫升）中30分鐘後，於37℃烘乾，真空封裝，置4℃備用。

6硝酸纖維素膜的包被

用Biodot點膜儀將純化的牛型分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB70（濃度為3毫克/毫升）包被於硝酸纖維素膜作為檢測線，包被量為0.6微升/cm，檢測線靠近結合墊端，距結合墊墊端約8毫米；用Biodot點膜儀將純化的兔抗MPB83蛋白的IgG抗體（濃度2毫克/毫升）包被於硝酸纖維素膜作為質控線，包被量為0.6微升/cm，質控線靠近吸水墊，距吸收墊約8毫米，兩線距離5～8毫米。37℃烘乾，封裝備用。

7試紙條的組裝

將樣品墊（1）、結合墊（2）、硝酸纖維素膜（3）、吸水墊（4）按圖2所示的順序依次粘附在PVC背襯（7）上，切成3毫米寬的小條，真空封裝。4～8℃保存，有效期2年；常溫保存，有效期12個月。

實施例3（套用實施例）

牛結核抗體的免疫膠體金試紙條使用方法

1、血清樣品的預處理

取牛血清樣品經4000轉/分鐘離心10分鐘去掉血細胞，20℃長期保存，4℃短期保存。

2、檢測步驟

用吸管吸取150微升待檢血清緩慢滴加在膠體金試紙條的加樣孔上，20分鐘後觀察結果。

3、結果判定

如圖3所示，若待測樣品試紙條檢測線顏色明顯深於陽性標準品試紙條檢測線顏色，同時質控線上出現紅色條帶則判斷為陽性樣品，即待測樣品中有牛結核分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83和MPB70的抗體，說明該牛為結核病牛；若待測樣品試紙條檢測線無顏色出現，同時質控線上出現紅色條帶則判斷為陰性樣品，即待測樣品中沒有牛結核分枝桿菌特異性分泌蛋白MPB83和MPB70的抗體，說明該牛為結核陰性牛；若待測樣品試紙條檢測線顏色介於陽性標準品和陰性標準品試紙條檢測線顏色之間，同時質控線上出現紅色條帶則判斷為可疑樣品，說明該牛疑似結核病；如果質控線上沒有紅色條帶出現，則該試紙條無效。

實施例4（套用實施例）

該實施例中所指的檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙檢測方法參照實施例3所述的操作步驟，其檢測結果如表1、表2和表3。

1、特異性試驗

按實施例3所述方法進行試驗，檢測牛結核陽性和牛結核陰性血清（由該實驗室保存，經PPD皮試、ELISA、病理學和細菌學檢驗）、副結核病牛血清、布病牛血清、弓形蟲病牛血清和口蹄疫牛血清（均購自中國獸醫監察所）。試驗結果（見表1）表明，副結核病牛血清、布病牛血清、弓形蟲病牛血清和口蹄疫牛血清樣品檢測線均無顏色出現，同時質控線上出現紅色條帶。《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》試紙條與牛的其他疾病無交叉反應，顯示《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》試紙條具有好的特異性。

表1 本發明的試紙條的特異性試驗

註：“+”表示陽性，“—”表示陰性。

2、敏感性試驗

按實施例3所述方法進行試驗，將10份牛結核陽性血清倍比稀釋後用《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》研製的試紙條檢測，並與該申請人在前研製出的間接血凝檢測牛結核抗體的試劑盒（200510019996.1專利申請的試劑盒）和韓國同類試紙條進行比較（結果見表2）。比較結果顯示：《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》研製的試紙條敏感性明顯高於200510019996.1專利申請的試劑盒（間接血凝）和韓國同類試紙條。

表2 本發明試紙條與本申請人在前專利申請和韓國同類試紙條的敏

註：表2中第1行的數字表示待檢的從1份-10份陽性血清，表第2-4行的數字表示能檢測到陽性最高稀釋倍數。

3、與結核菌素皮內變態反應（TST）比較試驗

按實施例3所述方法進行試驗，將61份臨床牛血清樣品用《檢測牛結核抗體的免疫膠體金試紙條及製備方法》研製的牛結核病抗體檢測試紙條檢測，並與TST方法做比較（結果見表3）。比較結果顯示：TST陽性牛9頭，其中試紙條檢測判斷3頭為陰性，陽性符合率為66.66％。TST陰性牛52頭，其中試紙條檢測判斷43頭為陰性，陰性符合率為82.69％。總符合率為80.33％。