棘阿米巴絲氨基代謝通路的分析及其調控研究

《棘阿米巴絲氨基代謝通路的分析及其調控研究》是依託復旦大學，由程訓佳擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：棘阿米巴絲氨基代謝通路的分析及其調控研究
• 依託單位：復旦大學
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：程訓佳

項目摘要

已經證實絲氨酸和半胱氨酸代謝對溶組織內阿米巴的生存和致病有至關重要作用，但是對棘阿米巴的相關代謝通路目前還知之甚少。我們前期的工作證實棘阿米巴絲氨酸代謝通路上的兩個限速酶的存在；同時一系列的實驗結果也發現蟲體絲氨酸合成受到抑制後，嚴重影響了蟲體的存活及生長。因此我們假設絲氨酸代謝是棘阿米巴代謝樞紐之一，調控下游胺基酸的合成，進而調節相關蛋白酶的表達，影響棘阿米巴的生物學特性和致病性。本課題擬在前期的研究基礎上，套用蛋白質組學、質譜流式細胞術、RNA干擾或轉染過表達等多種技術深入研究棘阿米巴絲氨酸代謝通路的性質和功能，證明代謝限速酶的作用及其對半胱氨酸合成代謝的調控的方式，探索絲氨酸代謝對相關蛋白酶表達的影響以及闡明其影響棘阿米巴的生存生長、抗氧化、附著乃至致病的機制。為棘阿米巴的生長機制和發病機理提供新理論依據，從而為棘阿米巴感染的早期明確診斷、有效治療藥物的篩選和高危人群的預防奠定基礎。

結題摘要

棘阿米巴是自生生活的原蟲，感染人體後可引起棘阿米巴角膜炎，在免疫抑制的人群中還可引起肉芽腫性阿米巴腦炎和阿米巴慢性皮膚潰瘍等疾病。對人類健康已造成新的威脅，是重要的公共衛生問題。本課題研究棘阿米巴絲氨基代謝通路的分析及其調控，探討棘阿米巴原蟲的凋亡特徵，同時研究滋養體半胱氨酸合成途徑及上遊絲氨酸代謝的非磷酸化代謝通路的特徵，深入探究與其代謝相關的致病蛋白的特點，篩選出具有致病作用的蛋白酶，並探討了該致病蛋白酶導致宿主細胞病變的作用機制。套用酶的基因克隆、抗體製備、雷射共聚焦顯微鏡觀察等方法研究棘阿米巴滋養體半胱氨酸合成通路及上遊絲氨酸代謝的非磷酸化代謝途徑的特徵。套用雷射共聚焦顯微鏡觀察滋養體經脂肪酸處理後，caspase-3蛋白的活化水平；流式細胞術分析滋養體經外源性脂肪酸處理後，細胞膜磷酯醯絲氨酸的外翻水平和實時螢光定量PCR檢測滋養體中凋亡相關蛋白及自噬相關蛋白的表達水平。RNA干擾、抑制劑套用、基因重組等技術深入研究與棘阿米巴滋養體絲氨酸或半胱氨酸代謝相關的致病蛋白的特點。套用siRNA干擾棘阿米巴CP3蛋白酶的表達，將經siRNA干擾CP3蛋白酶表達後的滋養體與人角膜上皮細胞（human corneal epithelial cell，HCEC）共孵育，顯微鏡觀察各處理組中HCEC細胞的病變程度； CCK-8檢測各組中HCEC細胞的活力。實時螢光定量PCR檢測各組HCEC細胞中，PARs蛋白，及Ras家族蛋白的mRNA表達水平。Western blot分析各組HCEC細胞中，PARs蛋白下游的PI3K/Akt信號通路，及Ras蛋白下游的Raf/Erk/p53信號通路的活化水平。綜上，研究證明棘阿米巴存在由CS參與的半胱氨酸合成途徑和由GDH、SPAT參與的絲氨酸代謝的非磷酸化途徑。由於人體中缺乏CS基因，棘阿米巴CS還可作為抗棘阿米巴感染藥物的靶點。半胱氨酸蛋白酶家族蛋白在蟲體致病過程中發揮重要作用。而半胱氨酸作為半胱氨酸蛋白酶的中央活性殘基，可能影響滋養體半胱氨酸蛋白酶的水解活性，從而影響蟲體的致病力。為棘阿米巴的生長機制和發病機理提供了新理論依據，為有效治療藥物的篩選和高危人群的預防奠定基礎。