核酸擴增檢測

核酸擴增檢測是通過酶的作用將待檢核酸序列進行擴增，然後檢出的方法。主要包括聚合酶鏈反應、聚合酶鏈反應直接測序、原位聚合酶鏈反應和端粒重複序列擴增法。

基本介紹

• 中文名：核酸擴增檢測
• 臨床套用：從直觀的核酸序列研究癌基因突變

常見檢測方法

1．聚合酶鏈反應
利用DNA可在一定條件下發生變性，解離成單鏈，然後與異源核酸形成雙鏈的特性，先將模板基因熱變性，通過降溫使引物與單鏈DNA的互補序列復性，形成模板與引物複合物（退火），然後以引物為固定起點，用耐熱DNA聚合酶，由5′至3′方向合成DNA（引物延伸）“變性-退火-延伸”即為一個循環，經過20到30次循環，使核酸擴增2n倍，並進行核酸檢測。聚合酶鏈反應敏感性高、特異性強、簡便快捷，是有效的研究手段。
2．聚合酶鏈反應直接測序
在DNA序列分析中主要用來製備測序模板，即將目的DNA片段插入質粒或病毒載體中，然後讓其在宿主細菌細胞中增殖。優點是操作易於標準化，且通過依次測序反應，就能確定樣品中某個等位基因的順序。
3．原位聚合酶鏈反應
通過聚合酶鏈反應技術對靶核酸序列在染色體上或組織細胞內進行原位擴增，然後通過原位雜交方法檢查，從而對靶核酸進行定性、定位、定量分析。操作步驟：將組織取出後，在室溫或4℃固定8～24小時。用胰蛋白酶室溫下處理15分鐘，部分破壞細胞膜或核膜，提高核苷酸、引物、多聚酶向細胞內的滲透，然後進行聚合酶鏈反應擴增，用雜交法檢出增殖的DNA。
4．端粒重複序列擴增法
該方法是用細胞提取物在合成的單鏈寡核苷酸引物TTGGGG3′端上添加端粒DNA序列，用同位素標記的核苷酸dGTP標記核苷酸，6%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離產物，進行放射自顯影。

臨床套用

1．聚合酶鏈反應
可用於檢測由基因點突變、獲得啟動子、基因易位、重排、擴增等導致的癌基因的異常激活、抑癌基因的失活及檢測外源性腫瘤病毒。此外，檢測致癌基因的表達水平對選擇化療方案也具有一定的指導意義。
2．聚合酶鏈反應直接測序
從最直觀的核酸序列水平研究癌基因突變，為腫瘤的早期診斷及基因治療提供了理論依據，對引起致病突變的直接鑑定有助於揭示抗癌基因的失活及腫瘤的發病機制。
3．原位聚合酶鏈反應
由於該方法兼有聚合酶鏈反應的高靈敏性與原位雜交的細胞內定位兩大優點，在染色體重排與轉位遺傳理論及醫學診斷、病源探測等方面發揮重要作用。
4．端粒重複序列擴增法
端粒重複序列擴增法能從100個左右的正常細胞中檢出混雜在其中的一個腫瘤細胞的端粒酶活性，大大提高了檢出敏感性、速度和效果。但是由於在炎症、非腫瘤性增生即正常增生細胞中也存在明顯端粒酶活性，因而限制了該方法的實際套用。