核酸外切蛋白酶是一類能從多核苷酸鏈的一端開始按序催化水解3、5-磷酸二酯鍵,降解核苷酸的酶。其水解的最終產物是單個的核苷酸(DNA為dNMP,RNA為NMP)。按作用的特性差異可以將其分為單鏈的核酸外切蛋白酶和雙鏈的核酸外切蛋白酶。
大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ(exo Ⅲ)具有多種催化功能,可以降解雙鏈DNA分子中的許多類型的磷酸二酯鍵。其中主要的催化活性是催化雙鏈DNA按3′→5′的方向從3′-OH末端釋放5′-單核苷酸。大腸桿菌核酸外切酶Ⅲ(exoⅢ)通過其3′→5′外切酶活性使雙鏈DNA分子產生出單鏈區,經過這種修飾的DNA再配合使用Klenow酶,同時加進帶放射性同位素的核苷酸,便可以製備特異性的放射性探針。