《柯薩奇B3病毒阻滯Hela細胞於G1/S期的分子機制研究》是依託南昌大學，由黃孝天擔任項目負責人的地區科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：柯薩奇B3病毒阻滯Hela細胞於G1/S期的分子機制研究
- 項目類別：地區科學基金項目
- 項目負責人：黃孝天
- 依託單位：南昌大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
柯薩奇B3病毒（CVB3）可引起病毒性心肌炎，但其致病機制尚未完全闡明。申請人的前期工作發現，CVB3感染同步化細胞後，細胞周期主要停滯在G1/S期，並且利用酵母雙雜交技術從人心臟cDNA文庫中篩出了與CVB3 VP1相互作用的一種新蛋白- - MAT1。現已知MAT1作為亞單位，與CDK7和Cyclin H共同形成三聚體複合物CAK，且對CAK的活性起著分子開關的作用，調控細胞周期由G1期進入S期以及細胞的起始轉錄。本課題擬在此基礎上，深入研究人細胞內VP1和MAT1的直接作用，分析VP1和MAT1相互作用的各自必需區域；進而，採用流式細胞術探討VP1和MAT1相互作用對細胞周期的影響，利用免疫印跡技術分析VP1和MAT1相互作用對CAK活性和CDK7含量的影響，從而闡明兩種蛋白的相互作用與CVB3阻滯Hela細胞於G1/S期的關係，為了解CVB3所致心肌炎中的複雜分子機制奠定基礎。
結題摘要
申請人前期發現，CVB3感染導致細胞周期停滯在G1/S期，並且利用酵母雙雜交篩出了與CVB3 VP1相互作用的一種新蛋白——MAT1。現已知MAT1作為亞單位，與CDK7和Cyclin H共同形成三聚體複合物CAK，且對CAK的活性起著“分子開關”的作用。本課題在此基礎上，為了避免酵母雙雜交結果的假陽性,進一步在CVB3病毒感染的Hela細胞中通過雷射共聚焦顯微鏡觀察發現：VP1和MAT1在細胞內有相同的空間定位，可同時存在於細胞漿中。這種共定位現象也同樣出現在pBudCE4.1-VP1質粒轉染的Hela細胞漿中。而且，在CVB3感染的細胞中，採用細胞內免疫共沉澱技術證實VP1與MAT1在細胞記憶體在相互作用。進而，利用基因突變技術明確了與MAT1相互作用的VP1必需區域為VP1的C端（768-853aa），與VP1相互作用的MAT1必需區域為MAT1的C端（191-309aa）。而文獻報導，MAT1 的C端區域（229–309aa）也是其與CDK7/cyclin H 複合物相互作用的必需區域，是CDK7在細胞核中穩定存在並發揮活性的前提。我們的結果提示VP1 和CDK7/cyclin H 亞複合物共同競爭結合MAT1。流式細胞儀分析發現，pBudCE4.1-VP1和pBudCE4.1-VP1-D8（768-853aa）轉染組的G1期細胞比例明顯高於空質粒轉染組 (p＜0.05)。另一方面，隨著pBudCE4.1-VP1轉染時間及CVB3感染的延長，不僅細胞總蛋白中MAT1與CDK7表達量逐漸下調，而且，CAK複合物中CDK7的表達也逐漸地降低，但Cyclin H表達無明顯改變。CAK磷酸化功能檢測結果顯示，不僅CAK的底物RNA Pol II CTD及p-RNA Pol II CTD在各時間點中的表達量逐漸下調，而且磷酸化RNA Pol II CTD表達量占RNA Pol II CTD表達量的比例也逐漸地下降。綜上所述，柯薩奇B3病毒阻滯Hela細胞於G1/S期的分子機制可能是VP1，特別是VP1的C端（768-853aa）與MAT1在細胞內的相互作用，使得VP1與CDK7/Cyclin H亞複合物兩者分別與MAT1競爭性結合，引起CDK7穩定性下降，導致CAK複合物表達量減少以及活性下降，從而抑制細胞周期由G1期進入S期以及細胞的起始轉錄。
