整合型載體有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。
基本介紹
- 中文名：整合型載體
- 外文名：integrating vector
- 拼音：zhenghexingzaiti
- 類型：生物學
分類介紹,轉化基因,培養條件,
分類介紹
有pPIC3、pPIC9、pHIL-D1、pA0804、pA0815、pPSC3K等。典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶—1（AOX1）基因的啟動子和轉錄終止子（5'AOX1和3'AOX1），它們被多克隆位點（MCS）分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因（HIS4）選擇標記及3'AOX1區。當整合型載體轉化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。
轉化基因
經同一表達載體轉化後分離得到的不同轉化子，其產物的表達水平不同。即使受體染色體上重組了相同數目的表達盒。轉化子的表達情況也不近相同。因此，為了獲得高產量的表達菌株，需要對大量的轉化子進行篩選。小量搖瓶培養無疑是篩選轉化子簡便而有效的方法。但是由於在搖瓶培養中巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白的水平往往不能準確地反映罐發酵中的表達情況，使之成為令人頭痛的問題。主要原因是在搖瓶培養中，培養液的pH值無法控制，培養物通氣不充分及無法控制添加碳源的最適速率。但是為了避免對每一個表達菌株進行繁瑣的發酵罐培養條件的實驗，仍需摸索表達菌株的搖瓶培養條件，使其產物的表達量與預期的發酵罐培養結果相近。
培養條件
適宜的培養液緩衝系統及適當的發酵液pH值，以降低蛋白酶的活性；最大的通氣量；添加適量的蛋白腖或酪蛋白水解物以避免產物被蛋白酶降解並為外源蛋白的合成及分泌提供胺基酸和能量。在甘油作碳源的培養液中，細胞迅速生長，菌體密度逐漸增大，但此時外源基因的表達被完全抑制。而當甘油缺失或被完全消耗時，甲醇被添加到培養液中，誘導產生外源蛋白。此階段菌群生長遲緩，但產物表達旺盛。
巴斯德畢赤酵母表達外源蛋白分胞內的表達和分泌到胞外兩種方式。畢赤酵母本身不分泌內源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導分泌的信號序列。當然，利用外源蛋白本身的信號序列很方便，因為基因的全部編碼序列可以插入到表達載體的單個或多個克隆位點。但在許多例實驗中，巴斯德畢赤酵母不能利用外源基因本身的信號序列引導分泌。而由89個胺基酸組成的釀酒酵母的分泌信號——α交配因子引導序列已經成功地引導了幾種外源蛋白的分泌，如鼠表皮生長因子，產量達0.45g/L。
