《擬南芥中CDPK相關蛋白激酶參與調控ABA信號的分子機制研究》是依託武漢大學，由張蕾擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：擬南芥中CDPK相關蛋白激酶參與調控ABA信號的分子機制研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：張蕾
- 依託單位：武漢大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
CDPK相關蛋白激酶（CRKs）是植物鈣信號系統中重要的蛋白激酶，其激酶活性依賴於鈣和鈣調素，在生化性質上不同於CDPKs，但有關CRKs在植物中的功能研究鮮見報導。我們前期的研究發現擬南芥CRK5和其相互作用蛋白DWA4(DWD domain protein )可能參與了ABA調節的種子萌發過程。在此基礎上，本立項擬利用螢光互補和Co-IP方法進一步驗證二者的相互作用，並利用體外磷酸化實驗分析DWA4是否為CRK5激酶作用底物以及DWA4是否調節CRK5活性，結合遺傳學和分子生物學方法分析磷酸化作用以及二者的互作是否影響ABA調節的種子萌發。同時驗證CRK5和DWA4是否通過泛素降解系統降解ABI5參與調控種子萌發。最後初步探索研究CRK5是否與ABA/PYR /PP2C受體系統存在調節機制。本立項的研究將為揭示鈣信號系統、泛素連線酶系統與ABA信號轉導之間的調控機制提供有力的理論依據。
結題摘要
在植物體內，ABA信號的轉導和完成與鈣信號系統中的蛋白激酶存在著網路調控的關係，尤其是CDPK-SnRK蛋白激酶家族在其中發揮著重要的作用。酵母雙雜交實驗篩選和驗證得到39個與CRK5相互作用的蛋白，其中一個具有DWD結構域的相互作用蛋白的T-DNA插入突變體種子在萌發時表現出對ABA超敏感，該蛋白命名為DWA4，即DWD domain protein hypersensitive to ABA 4。DWA蛋白已經被證明是CUL4-E3泛素連線酶系統中的底物“adapter”，負責與ABI5相互作用，通過調節ABI5的泛素化降解參與ABA信號傳遞。Pull-down和BIFC實驗進一步驗證了CRK5和DWA4在細胞內的相互作用。同時，二者相互作用以後定位於細胞膜。基因槍實驗結果表明，CRK5單獨定位於細胞膜，而DWA4則定位於細胞膜和細胞核。體外泛素化實驗結果表明，CRK5的泛素化依賴於DWA4的表達。CRK5被報導參與了根的向地性生長，但是我們的實驗結果表明，雖然CRK5在細胞內降解受到抑制，但是細胞內過量的CRK5並不影響其參與根的向地性生長。上述研究成果已經在SCI雜誌上發表。我們同時研究了CRK5與DWA4之間的磷酸化作用。體外磷酸化檢測發現，DWA4可以被CRK5磷酸化；點突變結合體外磷酸化檢測結果證明在DWA4上70位的絲氨酸是主要的磷酸化位點；抗體檢測植物細胞內的DWA4，發現該蛋白在植物細胞記憶體在磷酸化狀態；在crk5突變體中，DWA4的磷酸化狀態發生了改變。上述結果暗示，CRK5參與了DWA4在細胞內的磷酸化作用。該部分的實驗結果已經投稿。進一步研究了CRK5和DWA4參與ABA信號調控中的分子機制。研究發現，在dwa4突變體種子在培養基中施加ABA的情況下，在萌發過程中，ABI5的降解被抑制；同樣CRK5過量表達植株的種子，在同樣情況下也有ABI5降解受抑制的現象。體外磷酸化實驗證明CRK5可以磷酸化ABI5；BIFC結果表明CRK5和ABI5相互作用，二者結合後定位的位置在膜以及細胞質中。
