《捻轉血矛線蟲Hc-dhs-28基因調控蟲體發育的作用機制》是依託浙江大學，由杜愛芳擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：捻轉血矛線蟲Hc-dhs-28基因調控蟲體發育的作用機制
- 依託單位：浙江大學
- 項目負責人：杜愛芳
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
捻轉血矛線蟲具有兩個生活階段，普遍認為在寄生階段，營自由生活時期發生的脂肪酸β-氧化作用會因宿主體內的微氧環境而受到抑制。申請者所在團隊研究線蟲發育機制過程中獲得了1個與模式生物秀麗隱桿線蟲的長鏈脂肪酸脫氫酶基因同源的新基因Hc-dhs-28；其功能域與人過氧化物酶體內脂肪酸β-氧化的限速酶17β-羥基類固醇脫氫酶 Ⅳ相似；對秀麗隱桿線蟲進行的RNAi能引起蟲體內出現明顯的脂肪積聚，形成與Ce-dhs-28突變體相似的表型。因此，Hc-dhs-28可能作為關鍵酶基因參與捻轉血矛線蟲過氧化物酶體的脂肪酸代謝，影響其發育。本項目擬從Hc-dhs-28的基因結構和Hc-DHS-28的酶活性研究切入，重點分析該基因參與線蟲有氧和微氧生活階段具體的生理功能，預期研究結果將為寄生線蟲有氧與微氧環境中脂肪酸的代謝機制提供直接證據，對揭示寄生線蟲獨特的生長發育機制具有重要的理論指導意義。
結題摘要
捻轉血矛線蟲寄生於反芻動物皺胃以吸血為生，嚴重影響養殖業發展。防治手段主要依賴化學藥物，而近年來耐藥現象頻繁出現使得藥物防控效果日漸減弱。篩選新型藥靶及疫苗開發是防治方法研究的重要方向。捻轉血矛線蟲滯育機制使其能夠躲避不利環境對自身的影響，是蟲體生存的重要保障之一。探明該機制的參與因子，對掌握蟲體發育調控機制進而實現該病的防控有重大意義。本研究擴增獲得新基因Hc-dhs-28，其cDNA全長1317 bp，DNA全長4615 bp，含有13個外顯子和12個內含子；分析預測發現具有短鏈脫氫酶及SCP 2類固醇結合域兩個功能域，C端具有SKL過氧化物酶體定位信號1（PTS 1）；表達特性分析發現其在滯育和自由生活階段轉錄水平較高，表達部位集中於腸道和皮下，寄生階段轉錄和表達水平均較低；通過原核表達獲得正常Hc-DHS-28和功能域關鍵位點突變重組蛋白，並進行體外酶活動力學試驗，證實該蛋白具有短鏈羥醯基輔酶A脫氫酶功能活性，且121、149、162、166位胺基酸為活性關鍵位點；在HEK293細胞中觀察Hc-DHS-28與過氧化物酶體及線粒體的共定位，發現PTS1定位信號SKL能在C端末尾發揮過氧化物酶體定位功能，並幫助蛋白表達於細胞質過氧化物酶體中；利用C. elegans研究其對線蟲發育調控的作用，發現與前期表達定位結果一致即集中表達於腸道及皮下；能部分拯救Ce-dhs-28功能缺失VS8缺失株蟲體的體長、產卵量等指標，並能延長蟲體在飢餓應激下的壽命；對野生株RNAi後包含Ce-dhs-28在內的整條過氧化物酶體脂肪酸β氧化通路中的基因轉錄水平均顯著下降，且蟲體體長縮短，產卵量下降，出現脂肪沉積和大脂滴，蟲卵滯留現象嚴重，飢餓應急下不能進入滯育而死亡；利用原核表達蛋白進行免疫保護試驗，發現Hc-DHS-28重組蛋白具有良好的免疫原性，且免疫綿羊後能顯著減弱感染捻轉血矛線蟲後的體重損失，降低蟲荷量，使線蟲排卵高峰期提前，縮短雌蟲體長。本研究明確了Hc-dhs-28基因在蟲體發育調控過程中的功能，驗證了其作為疫苗候選抗原的潛能，為後續進一步探索線蟲滯育形成機制及藥靶篩選和疫苗開發奠定了堅實的基礎。
