基本介紹
- 中文名：手性色譜柱
- 外文名：Chiral HPLC Columns
- 定義：具有光學活性的單體
- 特點：固定在矽膠或其它聚合物上
通過引入手性環境使對映異構體間呈現物理特徵的差異，從而達到光學異構體拆分的目的。要實現手性識別，手性化合物分子與手性固定相之間至少存在三種相互作用。這種相互作用包括氫鍵、偶級-偶級作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用或空間作用。手性分離效果是多種相互作用共同作用的結果。這些相互作用通過影響包埋複合物的形成，特殊位點與分析物的鍵合等而改變手性分離結果。由於這種作用力較微弱，因此需要仔細調節、最佳化流動相和溫度以達到最佳分離效果。
手性色譜柱的分類及套用
迄今為止，尚沒有一種類似十八烷基鍵合矽膠（ODS）柱的普遍適用的手性柱。不同化學性質的異構體不得不採用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱通常價格昂貴，因此如何根據化合物的分子結構選擇適用的手性色譜柱是非常重要的。
根據手性固定相和溶劑的相互作用機制，Irving Wainer首次提出了手性色譜柱的分類體系：
第1類：通過氫鍵、π-π作用、偶級-偶級作用形成複合物。
第2類：既有類型1中的相互作用，又存在包埋複合物。此類手性色譜柱中典型的是由纖維素及其衍生物製成的手性色譜柱。
第3類：基於溶劑進入手性空穴形成包埋複合物。這類手性色譜柱中最典型的是由Armstrong教授開發的環糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色譜柱也屬於此類。
第4類：基於形成非對映體的金屬絡合物，是由Davankov開發的手性分離技術，也稱為手性配位交換色譜（CLEC）。
第5類：蛋白質型手性色譜柱。手性分離是基於疏水相互作用和極性相互作用實現。
但是，隨著由於市場上可選擇的手性色譜柱越來越多，此分類系統有時很難將一些手性柱歸納進去。因此參考Irving Wainer的分類方法，根據固定相的化學結構，將手性色譜柱分為以下幾種：
刷（Brush）型或稱為Prikle型
纖維素（Cellulose）型
環糊精（Cyclodextrin）型
大環抗生素（Macrocyclicantibiotics）型
蛋白質（Protein）型
配位交換（|Ligandexchange）型
冠醚（Crown ethers）型
1、刷型：
刷型手性色譜柱的出現和發展源於Bill Prikle及其同事的卓越工作。六十年代，Bill Prikle將手性核磁共振中的成果運用到手性HPLC固定相研究中，通過不斷實踐，發明了套用範圍較廣、柱效很好的手性色譜柱。刷型手性色譜柱是根據三點識別模式設計的，屬於Irving Wainer分類中的第一種類型。
刷型手性固定相分為π電子接受型和π電子提供型兩類。最常見的π電子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲醯苯基甘氨酸鍵合到γ-氨丙基矽膠上的製成。此類刷型手性色譜柱可以分離許多可提供π電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對化合物進行衍生化後進行手性分離。
π電子供給型固定相常見的是共價結合到矽膠上的萘基胺基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有π電子接受基團，例如二硝基苯甲醯基。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲醯、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進行衍生化後，用π電子供給型固定相達到手性分離。
刷型固定相的優勢在於其易於合成。合成方法在Bill Prikle的著作中有詳細的說明。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的不利之處在於它僅對芳香族化合物有效，有時不得不進行衍生化反應。但值得一提的是，這種衍生化反應是非手性衍生反應，所以不存在手性衍生的問題。刷型手性色譜使用的流動相基本是極性弱的有機溶劑，這對於製備色譜來講未必是缺點。
近來，刷型固定相出現了π電子供給和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分適用於β-阻斷劑的手性分離。典型的流動相為二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例為85：10：5。加入10mM醋酸銨可以調整保留時間。SS BLAMO Ⅱ，同時具有π電子供體區和受體區，形成手性裂縫，因此對於某些分子具有很高選擇性。
2、纖維素型：
纖維素型手性色譜柱的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋複合物。它們屬於Wainer分類中的第2種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基胺基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過此類型的色譜柱得到分離。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。流動相使用低極性溶劑，典型的流動相為異丙醇-正己烷混合物。這類柱子根據製作工藝，分為塗敷與鍵合兩大類。但特別要注意由於氯可以使塗敷纖維素從矽膠上脫落，因此要確保塗敷類柱子流動相中無含氯溶劑。
3、環糊精型：
環糊精是通過BacillusMacerans 澱粉酶或環糊精糖基轉移酶水解澱粉得到的環型低聚糖。通過控制環糊精轉移酶的水解反應條件可得到不同尺寸的環糊精。市售的環糊精主要是α、β、γ三種類型，分別含6、7、8個吡喃葡萄糖單元。環糊精分子成錐筒型，構成一個洞穴，洞穴的孔徑由構成環糊精的吡喃葡萄糖的數目決定。環糊精類型及洞穴的孔徑等見下表：
迄今為止，尚沒有一種類似十八烷基鍵合矽膠（ODS）柱的普遍適用的手性柱。不同化學性質的異構體不得不採用不同類型的手性柱，而市售的手性色譜柱通常價格昂貴，因此如何根據化合物的分子結構選擇適用的手性色譜柱是非常重要的。
根據手性固定相和溶劑的相互作用機制，Irving Wainer首次提出了手性色譜柱的分類體系：
第1類：通過氫鍵、π-π作用、偶級-偶級作用形成複合物。
第2類：既有類型1中的相互作用，又存在包埋複合物。此類手性色譜柱中典型的是由纖維素及其衍生物製成的手性色譜柱。
第3類：基於溶劑進入手性空穴形成包埋複合物。這類手性色譜柱中最典型的是由Armstrong教授開發的環糊精型手性柱[2]，另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物，如聚（苯基甲基甲基丙烯酸酯）形成的手性色譜柱也屬於此類。
第4類：基於形成非對映體的金屬絡合物，是由Davankov開發的手性分離技術，也稱為手性配位交換色譜（CLEC）。
第5類：蛋白質型手性色譜柱。手性分離是基於疏水相互作用和極性相互作用實現。
但是，隨著由於市場上可選擇的手性色譜柱越來越多，此分類系統有時很難將一些手性柱歸納進去。因此參考Irving Wainer的分類方法，根據固定相的化學結構，將手性色譜柱分為以下幾種：
刷（Brush）型或稱為Prikle型
纖維素（Cellulose）型
環糊精（Cyclodextrin）型
大環抗生素（Macrocyclicantibiotics）型
蛋白質（Protein）型
配位交換（|Ligandexchange）型
冠醚（Crown ethers）型
1、刷型：
刷型手性色譜柱的出現和發展源於Bill Prikle及其同事的卓越工作。六十年代，Bill Prikle將手性核磁共振中的成果運用到手性HPLC固定相研究中，通過不斷實踐，發明了套用範圍較廣、柱效很好的手性色譜柱。刷型手性色譜柱是根據三點識別模式設計的，屬於Irving Wainer分類中的第一種類型。
刷型手性固定相分為π電子接受型和π電子提供型兩類。最常見的π電子接受型固定相是由（R）-N-3，5-二硝基苯甲醯苯基甘氨酸鍵合到γ-氨丙基矽膠上的製成。此類刷型手性色譜柱可以分離許多可提供π電子的芳香族化合物，或用氯化萘酚等對化合物進行衍生化後進行手性分離。
π電子供給型固定相常見的是共價結合到矽膠上的萘基胺基酸衍生物，這種固定相要求被分析物具有π電子接受基團，例如二硝基苯甲醯基。醇類、羧酸類、胺類等，可以用氯化二硝基苯甲醯、異腈酸鹽、或二硝基苯胺等進行衍生化後，用π電子供給型固定相達到手性分離。
刷型固定相的優勢在於其易於合成。合成方法在Bill Prikle的著作中有詳細的說明。另外，刷型固定相具有高的容量因子，因此具有高的選擇因子。它的不利之處在於它僅對芳香族化合物有效，有時不得不進行衍生化反應。但值得一提的是，這種衍生化反應是非手性衍生反應，所以不存在手性衍生的問題。刷型手性色譜使用的流動相基本是極性弱的有機溶劑，這對於製備色譜來講未必是缺點。
近來，刷型固定相出現了π電子供給和接受基因的混合固定相。如：WHELK-O和BLAMO，及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分適用於β-阻斷劑的手性分離。典型的流動相為二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物，比例為85：10：5。加入10mM醋酸銨可以調整保留時間。SS BLAMO Ⅱ，同時具有π電子供體區和受體區，形成手性裂縫，因此對於某些分子具有很高選擇性。
2、纖維素型：
纖維素型手性色譜柱的分離作用包括相互吸引的作用及形成包埋複合物。它們屬於Wainer分類中的第2種類型。市售的手性色譜柱為微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基胺基酸鹽纖維素固定相。很多化合物可通過此類型的色譜柱得到分離。這種類型的手性色譜柱種類也很齊全。流動相使用低極性溶劑，典型的流動相為異丙醇-正己烷混合物。這類柱子根據製作工藝，分為塗敷與鍵合兩大類。但特別要注意由於氯可以使塗敷纖維素從矽膠上脫落，因此要確保塗敷類柱子流動相中無含氯溶劑。
3、環糊精型：
環糊精是通過BacillusMacerans 澱粉酶或環糊精糖基轉移酶水解澱粉得到的環型低聚糖。通過控制環糊精轉移酶的水解反應條件可得到不同尺寸的環糊精。市售的環糊精主要是α、β、γ三種類型，分別含6、7、8個吡喃葡萄糖單元。環糊精分子成錐筒型，構成一個洞穴，洞穴的孔徑由構成環糊精的吡喃葡萄糖的數目決定。環糊精類型及洞穴的孔徑等見下表：
環糊精 糖元數目 洞穴孔徑 可進入洞穴的分子類型，手性中心數目
α 6 4.5-6.0 5-6元環的芳香族化合物，30
β 7 6.0-8.0 聯苯或萘， 35
γ 8 8.0-10.0 取代芘和類固醇， 40
α 6 4.5-6.0 5-6元環的芳香族化合物，30
β 7 6.0-8.0 聯苯或萘， 35
γ 8 8.0-10.0 取代芘和類固醇， 40
2，3位仲羥基分布在環糊精洞口，6位伯羥基在環糊精分子的外部，這意味著洞穴內部是相對疏水的區域。用環糊精手性固定相產生手性識別要求被拆分物的疏水部分能嵌入環糊精洞穴中，形成可逆的、穩定性不同的包合物，環糊精洞口的羥基和被拆分物的極性基團相互作用。
由於形成包合物速度較慢，因此可能導致色譜峰峰形較差，同樣也影響了其在製備色譜中的套用。環糊精固定相的選擇性取決分析物的分子大小；α-環糊精只能允許單苯基或萘基進入，β-環糊精允許萘基及多取代的苯基進入，γ-環糊精僅用於大分子萜類。β-環糊精手性固定相套用範圍最廣。Ibuprofen通過β-環糊精色譜柱得到分離，說明了pH值對氫鍵的影響。當流動相的pH=7時，觀察不到拆分的跡象。pH=4時，可達到好的分離效果。通常分離胺基酸時，常採用低的pH值，以抑制酸性基團的離子化，同時也增強氨基的質子化。磷酸三乙胺鹽、乙酸三乙胺鹽證明對β-環糊精色譜柱來說是很好的緩衝液。通常緩衝液是0.1%三乙胺溶液，用磷酸或醋酸調節到合適的pH值。高的流速會降低形成複合物的能力，低流速分離效果較好，0.5-1ml/min的流速最好。另外，增加緩衝液的濃度可以克服流速的影響，因為它可以增加環糊精洞穴和流動相的吸引力。
常用緩衝液及其使用濃度如下表所示：
緩衝液濃度 目的
TEAA（乙酸三乙胺鹽） 0.01-2%
NH4NO3 10-500mM (用於減小包埋)
檸檬酸鹽 10-200mM (特別適合於酸性化合物)
醋酸銨10-200mM
pH值選擇見下表:
緩衝液 pH值 目的
醇和胺 pH4 (加強NH的離子化)
酸 pH7
緩衝液濃度 目的
TEAA（乙酸三乙胺鹽） 0.01-2%
NH4NO3 10-500mM (用於減小包埋)
檸檬酸鹽 10-200mM (特別適合於酸性化合物)
醋酸銨10-200mM
pH值選擇見下表:
緩衝液 pH值 目的
醇和胺 pH4 (加強NH的離子化)
酸 pH7
最佳化手性分離條件要考慮的方面有：pH值對分離度的影響；流速對分離度的影響；柱溫、有機相比例、緩衝鹽濃度對分離度的影響。
環糊精的修飾：最近，對環糊精的修飾使環糊精型手性色譜柱可以分離更多的化合物，並可用於氣相手性色譜分離。衍生化是通過將不同的基因鍵合到環糊精洞穴表面的羥基上。衍生化反應包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3，5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環狀對甲苯醯酯。這些新型的環糊精固定相有許多優點，它們可以分離更多化合物，價格上也有競爭力，由於改進了手性識別能力使其更適用於製備色譜。
環糊精的修飾：最近，對環糊精的修飾使環糊精型手性色譜柱可以分離更多的化合物，並可用於氣相手性色譜分離。衍生化是通過將不同的基因鍵合到環糊精洞穴表面的羥基上。衍生化反應包括乙基化、S-羥基丙基化、生成S或R-萘基乙基氨基甲酸鹽、3，5二甲基苯基氨基甲酸鹽和環狀對甲苯醯酯。這些新型的環糊精固定相有許多優點，它們可以分離更多化合物，價格上也有競爭力，由於改進了手性識別能力使其更適用於製備色譜。
4、配位交換型：
手性配位交換色譜（Chiral LigandExchange Chromatography，CLEC）由
Davankov發明，是通過形成光學活性的金屬絡合物而達到手性分離，屬於Irving Wainer分類中的第4類手性固定相，主要用於分離胺基酸類。
手性配位交換色譜（Chiral LigandExchange Chromatography，CLEC）由
Davankov發明，是通過形成光學活性的金屬絡合物而達到手性分離，屬於Irving Wainer分類中的第4類手性固定相，主要用於分離胺基酸類。
由於此類固定相是由手性胺基酸—銅離子絡合物鍵合到矽膠或聚合物上形
成，因此流動相中必須含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過渡金屬元素也已用於手性配位交換色譜，但銅離子套用最廣。形成絡合物的過程十分緩慢，因此有時需提高柱溫，最佳溫度約50℃。
成，因此流動相中必須含有銅離子以保證手性固定相上的銅離子不至流失。其它的過渡金屬元素也已用於手性配位交換色譜，但銅離子套用最廣。形成絡合物的過程十分緩慢，因此有時需提高柱溫，最佳溫度約50℃。
手性配位交換色譜僅對α- 胺基酸和其類似物有效。β- 胺基酸很難用手性
配位交換色譜得以分離。手性配位交換色譜可用於製備，由於流動相中存在銅離子，雖然銅離子能用離子交換柱除去，但增加了樣品處理的困難。
配位交換色譜得以分離。手性配位交換色譜可用於製備，由於流動相中存在銅離子，雖然銅離子能用離子交換柱除去，但增加了樣品處理的困難。
5、大環抗生素型：
大環抗生素型手性色譜柱是最近發展起來的，通過將大環抗生素鍵合到膠
上製成的新型手性色譜柱。大環抗生素型手性色譜柱的出現歸功於Dan Armstron 的貢獻。此類色譜柱常用的大環抗生素主要由三種：利福黴素（Rifamycin），萬古黴素（Vancomycin），替考拉寧（Ticoplanin）。利福黴素作為手性添加劑在毛細管電泳分離手性化合物方面得到了成功運用。萬古黴素和替考拉寧分子結構中存在“杯”狀結構區和糖“平面” 結構區。此類色譜柱性質穩定，可用於多種分離模式。手性分離基於氫鍵、π-π作用、形成包合物、離子作用和肽鍵等。
替考拉寧分子量為1885，結構中存在20個手性中心，3個糖基和4個環。酸性基團在多肽“杯”/ “裂層”的一端，鹼性基團在它的另一端。酸性基團和鹼性基團提供了離子作用點。糖基在三個平面上，可摺疊起來將化合物分子包埋在多肽“杯”中。
萬古黴素分子量為1449，結構中存在18個手性中心，3個環。萬古黴素具有“籃狀”結構，它的附近還有一個可彎曲的糖平面，可將分析物分子包埋在“籃子”中。羧基和仲氨基分布在“籃子”的邊緣，參與和分析物分子產生離子作用。萬古黴素手性色譜柱可用於反相模式、正相模式和極性模式。萬古黴素手性色譜柱可以分離胺類、中性醯胺、脂類。但對於酸性化合物選擇性較低。在反相模式中，有機相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸緩衝液。色譜柱適用的pH範圍為4-7。通常最佳化鹼性化合物手性分離條件時，選擇pH=7 為起點比較好。另外四氫呋喃、乙腈有最好的選擇性。有時採用純的甲醇和乙醇作流動相也可達到好的分離效果。萬古黴素手性色譜柱也可用正相模式，採用正己烷/乙醇為流動相。
萬古黴素手性色譜柱載樣量可以很大，非常適用於製備色譜。
大環抗生素型手性色譜柱是最近發展起來的，通過將大環抗生素鍵合到膠
上製成的新型手性色譜柱。大環抗生素型手性色譜柱的出現歸功於Dan Armstron 的貢獻。此類色譜柱常用的大環抗生素主要由三種：利福黴素（Rifamycin），萬古黴素（Vancomycin），替考拉寧（Ticoplanin）。利福黴素作為手性添加劑在毛細管電泳分離手性化合物方面得到了成功運用。萬古黴素和替考拉寧分子結構中存在“杯”狀結構區和糖“平面” 結構區。此類色譜柱性質穩定，可用於多種分離模式。手性分離基於氫鍵、π-π作用、形成包合物、離子作用和肽鍵等。
替考拉寧分子量為1885，結構中存在20個手性中心，3個糖基和4個環。酸性基團在多肽“杯”/ “裂層”的一端，鹼性基團在它的另一端。酸性基團和鹼性基團提供了離子作用點。糖基在三個平面上，可摺疊起來將化合物分子包埋在多肽“杯”中。
萬古黴素分子量為1449，結構中存在18個手性中心，3個環。萬古黴素具有“籃狀”結構，它的附近還有一個可彎曲的糖平面，可將分析物分子包埋在“籃子”中。羧基和仲氨基分布在“籃子”的邊緣，參與和分析物分子產生離子作用。萬古黴素手性色譜柱可用於反相模式、正相模式和極性模式。萬古黴素手性色譜柱可以分離胺類、中性醯胺、脂類。但對於酸性化合物選擇性較低。在反相模式中，有機相常用四氫呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三乙胺-乙酸緩衝液。色譜柱適用的pH範圍為4-7。通常最佳化鹼性化合物手性分離條件時，選擇pH=7 為起點比較好。另外四氫呋喃、乙腈有最好的選擇性。有時採用純的甲醇和乙醇作流動相也可達到好的分離效果。萬古黴素手性色譜柱也可用正相模式，採用正己烷/乙醇為流動相。
萬古黴素手性色譜柱載樣量可以很大，非常適用於製備色譜。
6、蛋白質型：
蛋白質型手性色譜柱屬於第5種類型。分離依賴於疏水相互作用和極性相互作用。已經有多種蛋白質用於此類手性色譜柱。使用較多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。
α-酸性糖蛋白分子由181個胺基酸殘基和40個唾液酸（sialic acid）殘基構成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點為2.7。含有兩個二硫鍵，性質很穩定。α-酸性糖蛋白分子可以共價鍵合到矽膠上，製成手性色譜柱，可以分離許多化合物。
α-酸性糖蛋白手性色譜柱使用的流動相通常為pH 4-7的磷酸鹽緩衝液和很小比例的有機相。有機相首選異丙醇，如達不到分離要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機相的改變導致蛋白結構發生暫時的改變。色譜柱的負載量至關重要，典型的負載量為0.02mg/ml的濃度樣品，進樣20μl。pH 的改變對手性選擇性起關鍵作用，尤其是胺類化合物。pH降低導致蛋白質負電荷的降低，引起胺類化合物保留時間減小，然而這意味著可以減小有機相比例，使選擇性增加，峰形改善。
通過調節有機相比例仍無法達到分離效果時，有時需用電荷調節劑。但這可能引起蛋白結構的永久改變，這些電荷調節劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時也用到1，2 亞乙基二醇，1，2丁醇和氯化鈉。溫度對分離也有影響，溫度增加保留時間，減小分離因子。
人血清白蛋白（HSA）分子量為69,000，等電點為4.8。蛋白中認為存在兩個藥物結合位點：華法令-氮雜普魯帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基二氮雜-吲哚（benzodiazapine-indole）結合位點。流動相中加入辛酸，採用人血清白蛋白手性色譜柱可以有效分離benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色譜柱得到了分離，流動相組成為：100mM磷酸緩衝液pH7：乙腈：異丙醇 = 84：10：6。
牛血清白蛋白（BSA）為球型蛋白，分子量為66,000，等電點為4.7。此蛋白為一個單胺基酸鏈，通過17個二硫鍵形成9個雙環。許多化合物通過牛血清白蛋白手性色譜柱得到分離。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白穩定，一些有機溶劑（如乙腈、甲醇）可使蛋白變性，因此使用起來要特別注意。
卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為55,000。它可分離大量的胺類和酸類化合物。
蛋白手性色譜柱的載樣量均較小。影響了蛋白手性色譜柱在製備色譜中的套用。
蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是套用最廣的色譜柱，但並不是效果最好的色譜柱。
蛋白質型手性色譜柱屬於第5種類型。分離依賴於疏水相互作用和極性相互作用。已經有多種蛋白質用於此類手性色譜柱。使用較多的是α-酸性糖蛋白（α-Acid Glycoprotein，AGP），人血清白蛋白（Human Serum Albumin，HSA），牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。
α-酸性糖蛋白分子由181個胺基酸殘基和40個唾液酸（sialic acid）殘基構成。α-酸性糖蛋白分子偏酸性，等電點為2.7。含有兩個二硫鍵，性質很穩定。α-酸性糖蛋白分子可以共價鍵合到矽膠上，製成手性色譜柱，可以分離許多化合物。
α-酸性糖蛋白手性色譜柱使用的流動相通常為pH 4-7的磷酸鹽緩衝液和很小比例的有機相。有機相首選異丙醇，如達不到分離要求，可以嘗試乙腈，乙醇，甲醇或四氫呋喃。有機相的改變導致蛋白結構發生暫時的改變。色譜柱的負載量至關重要，典型的負載量為0.02mg/ml的濃度樣品，進樣20μl。pH 的改變對手性選擇性起關鍵作用，尤其是胺類化合物。pH降低導致蛋白質負電荷的降低，引起胺類化合物保留時間減小，然而這意味著可以減小有機相比例，使選擇性增加，峰形改善。
通過調節有機相比例仍無法達到分離效果時，有時需用電荷調節劑。但這可能引起蛋白結構的永久改變，這些電荷調節劑包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有時也用到1，2 亞乙基二醇，1，2丁醇和氯化鈉。溫度對分離也有影響，溫度增加保留時間，減小分離因子。
人血清白蛋白（HSA）分子量為69,000，等電點為4.8。蛋白中認為存在兩個藥物結合位點：華法令-氮雜普魯帕宗（warfarin-azapropazone）和苯基二氮雜-吲哚（benzodiazapine-indole）結合位點。流動相中加入辛酸，採用人血清白蛋白手性色譜柱可以有效分離benzodiazapine。Warfarin 和oxazepam也用人血清白蛋白手性色譜柱得到了分離，流動相組成為：100mM磷酸緩衝液pH7：乙腈：異丙醇 = 84：10：6。
牛血清白蛋白（BSA）為球型蛋白，分子量為66,000，等電點為4.7。此蛋白為一個單胺基酸鏈，通過17個二硫鍵形成9個雙環。許多化合物通過牛血清白蛋白手性色譜柱得到分離。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白穩定，一些有機溶劑（如乙腈、甲醇）可使蛋白變性，因此使用起來要特別注意。
卵類粘蛋白由蛋清中提取，分子量為55,000。它可分離大量的胺類和酸類化合物。
蛋白手性色譜柱的載樣量均較小。影響了蛋白手性色譜柱在製備色譜中的套用。
蛋白手性色譜柱在所有手性色譜柱中是套用最廣的色譜柱，但並不是效果最好的色譜柱。
7、冠醚型：
冠醚類固定相用於分離一級胺，一級胺必須質子化方能達到分離。因此必須
使用酸性流動相，如高氯酸。最常用的是冠醚類固定相是18-冠-6，已有商品化
產品，由Daicel公司製造。無論（+）或（-）型均可達到有效分離，並可通過變化（+）（-）類型而改變分析物出峰順序。冠醚作為添加劑也用於核磁共振和電泳，但由於其毒性較大，有致癌性，使其套用受到限制。
冠醚類固定相用於分離一級胺，一級胺必須質子化方能達到分離。因此必須
使用酸性流動相，如高氯酸。最常用的是冠醚類固定相是18-冠-6，已有商品化
產品，由Daicel公司製造。無論（+）或（-）型均可達到有效分離，並可通過變化（+）（-）類型而改變分析物出峰順序。冠醚作為添加劑也用於核磁共振和電泳，但由於其毒性較大，有致癌性，使其套用受到限制。
手性柱生產廠家
在中國銷售使用的手性色譜柱大多是來自日本DAICEL、日本YMC、美國ASTEC等公司，廣州研創手性科技是中國國內唯一一家手性固定相及手性色譜柱生產廠家。
