《慢病毒Gag蛋白的SUMO化修飾對病毒複製的影響》是依託南開大學，由王穎擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：慢病毒Gag蛋白的SUMO化修飾對病毒複製的影響
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：王穎
- 依託單位：南開大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
慢病毒的Gag蛋白與基因組RNA共同構成病毒顆粒的核心。Gag蛋白在合成後沿微管運至細胞膜附近，微管運輸被阻斷後Gag將在細胞核周圍聚集，HIV Gag的SUMO化修飾亦得到證實。本課題以HIV和EIAV為材料，首次將Gag的SUMO化修飾與Gag的核周聚集和RNA包裝相聯繫，以SUMO化修飾對病毒複製和RNA包裝的影響為目標，通過①確認Gag蛋白的SUMO化修飾位點、②改變細胞內SUMO化狀態、③檢測Gag蛋白核周聚集和病毒RNA包裝的變化，結合Gag蛋白的聚集、Gag-RNA相互作用和病毒載量等指標，驗證如下模型：慢病毒Gag蛋白利用宿主的SUMO化修飾系統實現自身極化，在細胞核附近形成局部高濃度，有利於與病毒RNA的結合。本課題將闡明Gag蛋白SUMO化修飾的生物學意義和Gag核周聚集的分子機理，探索改變SUMO化水平干擾慢病毒複製的可能性，尋找控制慢病毒感染的新靶點。
結題摘要
Gag蛋白是包括慢病毒在內的反轉錄病毒的重要結構成分，在病毒生活周期的早期和晚期都發揮重要作用。Gag由基質蛋白(MA)、衣殼蛋白(CA)、核衣殼蛋白(NC)和C端的p9組成。SUMO化修飾（SUMOylation）是近年發現的翻譯後修飾，經一系列酶促反應，將小類泛素化修飾肽（small ubiquitin-like modifier，SUMO）共價連線到靶蛋白上，並由此改變其定位、穩定性及與其它蛋白的相互作用。本項目以馬傳染性貧血病毒(equine infectious anemia virus, EIAV)為材料，對Gag的SUMO化修飾進行了研究。首先製備了抗Gag、MA、CA、NC和p9的多克隆抗體。然後利用大腸桿菌表達/修飾系統，證實了Gag的SUMO化修飾，發現存在多個修飾位點。接著利用體外SUMO化修飾系統檢測到NC可以被修飾，但修飾主要發生在C端的p9上，且存在多個修飾位點。利用定點突變將p9的6個賴氨酸逐一突變為電荷不變的精氨酸，除K30突變體外，其它點突變的p9均能利用多個位點進行修飾，說明p9中存在多個修飾位點，而K30是主要位點之一。用親和層析對融合有6×組氨酸標籤的重組p9進行了純化，切取SDS-PAGE中推測發生了SUMO化修飾的p9條帶進行質譜分析，在三次重複中，除鑑定到p9片段（覆蓋率74.7％）和SUMO片段（覆蓋率28.9％）外，還鑑定到2個K5發生SUMO化修飾的分支片段，證實了p9 的SUMO化修飾，且K5是主要位點之一。此外利用缺失互補的方法證明了Ubc9及其C93在p9 SUMO化修飾中的作用。最後，將融合有EGFP標籤的Gag真核表達質粒轉染入293T細胞，利用雷射共聚焦顯微鏡觀測了Gag的亞細胞定位，研究了SUMO、Ubc9及泛素（ubiquitin）對Gag定位的影響：Gag主要定位於細胞質，但在細胞質中又不是彌散分布的，而是聚集成大小不等的斑塊。共轉染SUMO、Ubc9或泛素的真核表達質粒則EGFP-Gag的螢光強度、聚集成的斑塊數量、直徑及直徑的差異程度均有所變化。本項目首次證實了EIAV的Gag能被SUMO化修飾，鑑定了發生修飾的主要Gag組分及賴氨酸殘基，研究了SUMO化修飾對Gag在真核細胞中定位的影響。上述結果初步揭示了宿主的翻譯後修飾與病毒蛋白之間的關係，為開發慢病毒治療的藥物和疫苗提供了新靶點。
