《心肌細胞L型鈣通道CaV1.2的新調控蛋白PLM的功能研究》是依託武漢大學，由郭凱擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：心肌細胞L型鈣通道CaV1.2的新調控蛋白PLM的功能研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：郭凱
- 依託單位：武漢大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
L型鈣通道(LTCC)是心肌中主要的電壓依賴性鈣通道，參與心肌細胞動作電位平台期的形成和維持。激活LTCC引起少量鈣離子內流，後者觸發大量鈣離子從肌漿網中釋放出來，這一過程在心臟興奮收縮偶聯中起著關鍵作用。我們前期研究發現了LTCC的一個新的調控蛋白phospholemman(PLM)，並實驗證明在外源性表達載體HEK 293細胞中PLM與LTCC在細胞膜上共定位並相連線，PLM可以調節LTCC的電生理特性。但在生理情況下PLM對LTCC的作用卻不清楚。本項目通過在大鼠心肌細胞中過表達和抑制表達PLM來分析它對LTCC的調節作用。又PLM是心肌中一種主要的磷酸化底物，本項目將PLM不同磷酸位點一一突變來觀察它對LTCC的調節作用有無變化。為更全面地了解PLM調節LTCC的生理功能提供實驗依據，也為治療心力衰竭和心力衰竭後心律失常提供新的分子靶點。
結題摘要
研究背景：Phospholemman(PLM)是心肌細胞中一種重要的磷酸化底物，可以被蛋白激酶A(PKA)和蛋白激酶C(PKC)磷酸化。前期研究發現PLM與心肌細胞膜上L型鈣通道(L-type calcium channel, LTCC)相連並改變其通道動力學特性，但PLM不同磷酸化狀態對LTCC的影響還不清楚。本項目在HEK 293T細胞中轉染PLM磷酸化位點突變質粒，用膜片鉗記錄L型鈣電流(ICa(L))的變化。 研究內容：用丙氨酸(alanine, A)和天冬氨酸(aspartic acid, D)替代PLM 62、63、68號位絲氨酸(serine, S)、69號位蘇氨酸(threonine, T)，構建PLM去磷酸化質粒(6263AA、6869AA、AAAA)和PLM磷酸化質粒(6263DD、6869DD、DDDD)。將編碼LTCC的質粒分別與編碼野生型PLM(WT PLM)和突變型PLM的質粒轉染HEK 293T細胞，待目的蛋白表達後，用全細胞膜片鉗技術記錄ICa(L)並分析磷酸化和去磷酸化PLM對ICa(L)的影響。 研究結果：WT PLM顯著減慢LTCC的激活和滅活過程，同時加快LTCC的電壓依賴性失活過程。模擬PLM磷酸化的突變質粒(6263DD、6869DD、DDDD)可以增加ICa(L)電流密度。62、63號位絲氨酸磷酸化狀態改變PLM對LTCC的激活作用，表現為：6263AA促進了PLM減慢LTCC激活的作用，而6263DD抑制了該作用。68號位絲氨酸、69號位蘇氨酸磷酸化狀態改變PLM對LTCC的電壓依賴性失活作用，表現為：6869DD促進了PLM加快LTCC失活的作用。AAAA較6263AA更加減慢LTCC的激活，而DDDD較6869DD更加加快LTCC的失活。除了AAAA，其他5種突變型PLM均抑制PLM使LTCC滅活減慢的作用。 科學意義：本研究顯示PLM磷酸化加快了LTCC激活和失活過程，而PLM去磷酸化起到相反的作用。由於LTCC失活減慢與心律失常發生相關，促進PLM磷酸化可能是一個潛在的預防和治療心律失常的方法。
