弓形蟲SCD在硬脂酸代謝中的作用機制研究

《弓形蟲SCD在硬脂酸代謝中的作用機制研究》是依託中國農業大學，由劉群擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：弓形蟲SCD在硬脂酸代謝中的作用機制研究
• 依託單位：中國農業大學
• 項目負責人：劉群
• 項目類別：面上項目

項目摘要

弓形蟲的生長繁殖必須利用II型脂肪酸合成酶（FAS）合成脂肪酸，但弓形蟲的不飽和脂肪酸是完全需要自身合成還是可以從宿主細胞獲取尚不清楚。生物體內的硬脂酸必須利用硬脂醯CoA去飽和酶（SCD）催化生成油酸，但對弓形蟲SCD的表達、定位、功能及作用機制尚未認知。我們前期研究發現弓形蟲基因組中存在SCD基因，本項目擬通過生物信息學分析，獲取SCD的相關信息，進行基因擴增和蛋白表達，採用Real-time PCR和免疫印跡等技術驗證SCD在蟲體中的表達；採用間接免疫螢光和螢光示蹤技術進行蟲體內SCD亞細胞定位。套用酶抑制劑初步確定SCD在蟲體中的功能後，通過基因敲除和轉染技術分別構建基因缺失株、補足株和過表達株，觀察酶基因缺失、功能抑制和過表達時，蟲株生長、繁殖等的變化及對小鼠毒力的影響，揭示弓形蟲內源性SCD在其脂肪酸代謝中的作用機制，有可能發現抗弓形蟲藥的新靶點，為弓形蟲病的防控提供新思路。

結題摘要

硬脂醯輔酶A去飽和酶（stearoyl-coenzyme A desaturase, SCD）是不飽和脂肪酸合成關鍵酶。分析發現弓形蟲中存在與瘧原蟲SCD相似性達54%的推定脂醯輔酶A去飽和酶基因（ToxoDB編號TGGT1_238950），該基因編碼的蛋白質具有典型的去飽和酶結構域。通過反轉錄PCR獲得弓形蟲該基因的3129 bp全長編碼序列，與TGGT1_238950的序列完全一致。原核表達並製備鼠源抗體，蛋白印跡顯示弓形蟲速殖子中存在與預期相符一致的蛋白表達，分子量約為120 kDa。通過構建帶有HA標籤的該基因內源性標記蟲株，確認蟲體內源性蛋白定位於內質網，與其他生物細胞的去飽和酶定位一致，推定該蛋白為弓形蟲的硬脂醯輔酶A去飽和酶（TgSCD）。 環丙烯脂肪酸（如蘋婆酸）是SCD的抑制劑。我們選擇蘋婆酸以及幾種與其結構相似的甲酯化物作用於細胞培養中的弓形蟲，發現它們都能不同程度抑制胞內弓形蟲的增殖與釋放。其中含有甲氧基的編號INT21藥物對弓形蟲有明顯抑制作用，且對宿主細胞毒性較小，能夠顯著抑制Pru株感染小鼠的腦荷蟲量。 運用CRISPR/Cas9技術條件性敲除弓形蟲TATi蟲株的SCD。體外和體內實驗均發現敲除SCD後，蟲體的入侵、發育、繁殖以及對小鼠的致病性等無明顯變化，提示蟲體生長發育對SCD的依賴程度不高，或有其它因子替代或補償其功能。弓形蟲SCD過表達蟲株的入侵細胞的能力降低，增殖速度減慢，對小鼠的致病性下降。SCD過表達蟲株的油酸比例增加，證明弓形蟲SCD在蟲體內發揮了脂肪酸去飽和酶的功能；SCD過表達蟲株發生內質網應激，更易發生自噬和凋亡。 本項目研究確認了弓形蟲中存在SCD，且能夠發揮脂肪酸去飽和酶的功能，參與了蟲體自噬；但弓形蟲SCD的缺失對速殖子階段的生長繁殖沒有顯著影響，提示存在其它物質補償其功能。