《弓形蟲鈣依賴蛋白激酶對天然免疫應答調控機制的研究》是依託揚州大學，由黃思揚擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：弓形蟲鈣依賴蛋白激酶對天然免疫應答調控機制的研究
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：黃思揚
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
弓形蟲病是一種重要的人獸共患病，不僅嚴重威脅人類健康，而且是食品安全與畜牧業發展的重要隱患。制約有效防控弓形蟲病的主要原因是欠缺對該病的基礎研究，尤其是對弓形蟲入侵宿主引起的機體天然免疫應答的調節機制尚需進一步研究。鈣依賴蛋白激酶(CDPK)在弓形蟲中有12個成員，參與調節弓形蟲的滑動、入侵、增殖及釋放等重要生命過程，但是CDPK對宿主的免疫調節機制尚不明確。我們通過敲除弓形蟲TgCDPK5，發現其與蟲體生長發育密切相關，但具體機制尚不明確。本項目擬在前期研究基礎上，構建與入侵相關的TgCDPK5缺失株、TgCDPKx 缺失株以及TgCDPK5/x 雙基因缺失株，鑑定其生物學特性；通過蛋白或缺失株分別刺激DC細胞、巨噬細胞、小鼠脾細胞以及小鼠，分析天然免疫通路中相關因子的表達變化情況，解析弓形蟲CDPK對天然免疫應答的調控機制，為闡明弓形蟲入侵及感染的致病機制奠定基礎。
結題摘要
弓形蟲病是重要的食源性人獸共患寄生蟲病，其對畜牧業生產、寵物養殖及公共衛生安全的危害都十分重大。對弓形蟲入侵宿主引起的機體免疫應答的調節機制認識不足是對該病防控的主要障礙。本項目在前期研究工作的基礎上，套用分子生物學、功能基因組學、CRISPR/Cas9等技術手段，以鈣依賴蛋白激酶（CDPK）樣蛋白作為切入點進行上述研究。 1、本項目完成了對12個CDPK蛋白的表達和純化及抗體製備，明晰了弓形蟲不同應激（溫度、pH 值以及IFN-γ）條件下CDPK蛋白家族12個基因的表達差異。。 2、在生物信息學的幫助下，利用高效的CRISPR-Cas9技術，分別敲除了CDPK4、CDPK4A、CDPK5、CDPK6、CDPK8及CDPK9這六個基因，構建了相應的缺失株。對缺失株基本生物學功能進行了探究，通過雙基因缺失株的構建，進一步研究了CDPK家族中其他基因之間的的代償作用。 3、本項目探討CDPK2本身的基因功能及免疫保護性，我們將CDPK2基因構建到pVAXI中構建成DNA疫苗，進而評價了CDPK2基因的免疫原性及免疫保護性，探明其對小鼠弓形蟲感染具有部分保護性。 4、本項目成功構建了PRUΔCDPK2蟲株，並發現該缺失株喪失了形成包囊的能力，亦不能對小鼠體形成慢性感染，通過動物實驗，探明了免疫該缺失株機體產生的免疫應答情況，進而探究了該缺失株作為弱毒疫苗的可能性。結果表明該缺失株能夠引起機體的免疫反應，對弓形蟲的急慢性感染均起到免疫保護作用，接著探究了PRUΔCDPK2缺失株對弓形蟲先行性感染的免疫保護作用，結果顯示經PRUΔCDPK2缺失株免疫的雌鼠能夠明顯地提高胎兒的存活率及胎兒的體重，同時減少胎兒腦中包囊數量。因此，PRUΔCDPK2缺失株有望成為防控弓形蟲病的弱毒疫苗。 通過該項目的研究，對弓形蟲入侵宿主引起的機體免疫應答的調節機製取起到了較大的推動作用，為弓形蟲的疫苗研製及免疫防控奠定了理論基礎。
