辣根過氧化酶使試劑中的發光物（luminol）氧化並發光，而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中，將複雜的蛋白混合物經sds-page分離，並轉移到固相膜上（如nc、pvdf）等，用於免疫學檢測，經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）或間接（標記二抗）反應。
基本介紹
- 中文名：底物化學發光
- 外文名：Substrate chemiluminescence
- 用途：用於檢測固定在膜上的蛋白
- 儲存：2-8℃密封避光保存一年
英文名字,原理,用途,使用方法,操作注意,安全性,儲存,
英文名字
Chemiluminescent
原理
辣根過氧化酶使試劑中的發光物（luminol）氧化並發光，而試劑中含有增強劑這使得發光增強了1000倍。在免疫印跡中，將複雜的蛋白混合物經sds-page分離，並轉移到固相膜上（如nc、pvdf）等，用於免疫學檢測，經HRP標記的抗體與膜上的蛋白直接（標記一抗）或間接（標記二抗）反應。當加入免疫印跡化學發光試劑後，luminol發生氧化降解，並發射波長為428nm的光，此光可經x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。
用途
非放射性發光系統，用於檢測固定在膜上的蛋白，其敏感性達1-5pg。用x光片可快速地獲得永久的硬拷貝結果。所含獨特的底物足以維持12小時以上的發光，便於反覆曝光操作，免疫印跡膜經抗體脫卸處理後可供再次抗體探查使用。適用於痕量蛋白或核酸檢測。
使用方法
1. 印跡膜製備 按常規方法完成SDS-PAGE和電轉膜操作，適當的封閉非常重要。可以通過標記一抗或二抗的手段引入HRP，一般採用市售的HRP二抗交聯物。仔細地淋洗對於降低背景非常重要，在與HRP交聯物溫育後，膜片更需仔細洗滌，所有步驟均在室溫下完成。
2. 化學發光試劑的配置 在使用前等量混合a液和b液，混合後儘快使用。將膜片置混合液中於室溫下振盪溫育2分鐘，每平方厘米膜片至少使用0.1-0.2ml以覆蓋全膜片。
3.蛋白信號顯現
1). 用平頭鑷鉗住膜片，垂直置於吸水紙以吸去過量試劑。
2). 置膜片於二層保鮮膜之間，小心趕盡氣泡。
3). 將膜片吸附蛋白面朝上，置於x光片盒中。
4). 於暗室中壓上x光片。
5).根據信號的強弱適當調整曝光時間，一般為1min或5min，也可選擇不同時間多次壓片，以達最佳效果。顯影沖洗。
6). 調節曝光時間，再次曝光顯影。
4、膜的重複使用：
配置62.5mm tris-hcl,ph6.7,2%sds, 7ml/100ml的巰基乙醇的溶液，膜放入後，70?c振盪水浴30分鐘。再用tbst或pbst緩衝液洗脫，最後用bsa（牛血清白蛋白）或牛奶封閉。
操作注意
1. 試劑每個批號均獨立最佳化，請不要混用或稀釋試劑以免降低敏感性；
2. 加入一抗後膜不能再乾燥；
3. 適當地封閉和洗滌膜片至關重要；
4. 使用前配置化學發光試劑，配置足夠覆蓋膜片即可，棄去使用過的混合試劑；
5. 使用乾淨取樣頭取用每種試劑；
6. 第一張片子建議曝光1分鐘，觀察結果後判斷最佳曝光時間可從30秒至2小時不等；
7. 除了放射自顯影片曝光和洗片處理外，所有步驟均不必在暗室中操作；
8. 膜片可經適當方法洗脫原有抗體，再次印跡使用，在此情況下，此試劑更為理想；
9. 因為它不象生色物質需要從膜片上清除底物。
10. nan3能抑制HRP活性，應避免使用nan3。
安全性
無特殊毒性，按普通化學品處理。如果不慎與眼、皮膚和衣物接觸，請立刻用大量清水沖洗。
儲存
2-8℃密封避光保存一年。
