《岩藻糖基轉移酶對非天然供體底物選擇性的分子改造》是依託上海交通大學，由楊廣宇擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：岩藻糖基轉移酶對非天然供體底物選擇性的分子改造
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：楊廣宇
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
岩藻糖基轉移酶(FucT)催化反應將供體底物岩藻糖鳥苷二磷酸(GDP-岩藻糖)上的岩藻糖轉移至受體底物，在藥物相關寡糖合成中有重要價值，但其大規模套用受到昂貴的天然供體底物(GDP-岩藻糖)限制。我們前期研究發現，來源於幽門螺桿菌的FucT對廉價的、非天然糖基供體(α-氟代岩藻糖)也具有一定活性，進一步提升後有望替代GDP-岩藻糖為寡糖合成提供一條新途徑。對FucT的結構分析表明，其活性中心附近的5段短LOOP區可能是控制酶供體底物選擇性的關鍵。為探討酶對非天然底物的識別機制、構建高效進化酶，本項目擬對酶活性中心進行雜化，結合酶家族序列分析構建小型、智慧型半理性設計突變庫；套用我們前期發展的FACS篩選策略，建立針對FucT活性的超高通量篩選方法，篩選獲得對非天然底物具有高活性的進化酶；對突變體結構-功能關係分析，闡明FucT供體底物選擇性機制，為糖基轉移酶的分子改造提供理論指導。
結題摘要
岩藻糖基修飾的糖複合物具有重要的生理及藥物活性，然而大量合成此類化合物的主要瓶頸之一是岩藻糖基轉移酶(FucT)存在活性底、底物選擇性不適宜等問題。定向進化是改善酶功能的有效手段，但對岩藻糖基轉移酶的定向進化目前仍缺少高效的篩選方法。為構建高效進化酶並探討酶對非天然底物的識別機制，本項目合成了針對岩藻糖基轉移酶的特異性螢光探針，並利用大腸桿菌半乳糖透酶的底物選擇性，在國際上首次建立了針對α-1,2-FucT、α-1,3-FucT、岩藻糖苷酶的轉糖苷活性的FACS超高通量篩選方法，為岩藻糖基化酶的分子改造提供了有力的篩選工具；對來源於幽門螺旋桿菌的α-1,3-岩藻糖基轉移酶進行了定向進化研究，獲得了底物催化活性均顯著提高、底物譜明顯拓寬的進化酶，其中M32針對不同底物的催化活性提升了4-8.5倍，達到目前已報導的最高水平；通過解析和比較α-1,3-FucT天然酶及其突變體的晶體結構，進一步對其催化非天然底物的選擇性機制進行了研究，發現GT-B摺疊酶的鉸鏈區對底物選擇性的調控機制，為其它糖基轉移酶的分子改造提供了理論指導和技術支撐。
