實用哺乳動物細胞培養手冊

細胞培養是指從體內組織取出細胞在體外模擬體內環境下，使其生長繁殖，並維持其結構和功能的一種培養技術。細胞培養的培養物可以是單個細胞，也可以是細胞群。

實驗室設計

細胞培養是一種無菌操作技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受其它有害因素的影響。細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔、空氣清新，乾燥和無煙塵。細胞培養室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培養於一室，而洗刷消毒在另一室。

常用設施及設備

⑴超淨工作檯：也稱淨化工作檯，分為側流式、直流式和外流式三大類。

⑵無菌操作間：一般由更衣間、緩衝間和操作間三部分組成。操作間放置淨化工作檯及二氧化碳培養箱、離心機、倒置顯微鏡等。緩衝間可放置電冰櫃、冷藏器及消毒好的無菌物品等。

⑶操作間：普通培養箱、離心機、水浴鍋、定時鐘、普通天平及日常分析處理物

⑷洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。

⑸分析間：顯微鏡、計算機及印表機等。

培養器皿

常用細胞培養器皿有培養瓶、培養板、培養皿等。常準備量是使用量的三倍。器皿應選擇透明度好、無毒、利於細胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料製品或中性硬度玻璃製品。常用的器皿有下面幾種。

⑴液體儲存瓶：用於儲存各種配製好的培養液、血清等液體，常用規格有500ml、250ml、100ml 等幾種。

⑵培養瓶：根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異，用於細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便於細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小於1cm，允許吸管伸入瓶內任何部位，規格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等幾種。

⑶培養皿：用於開放式培養及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm 等幾種。

⑷吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管。其改良後管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用於移動液體。常用1ml 和10ml 兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。

⑸離心管：離心管是細胞培養中使用最廣泛的器皿，根據用途不同形態各樣，常用於細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；後者則多為10ml 和5ml。

⑹其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。

細胞培養

科學研究

1. 藥物研究與開發

⑴ 新藥篩選：如化學合成藥物藥效研究，中藥有效成分篩選與鑑定等.

⑵ 疫苗研究與開發：如病毒性疫苗的研究與開發（肝炎病毒疫苗，愛滋病疫苗等），腫瘤疫苗（多肽疫苗）等.

⑶ 基因工程藥物研究與開發：如干擾素研究與開發，細胞生長因子研究與開發等.

⑷ 細胞工程藥物研究與開發：生物活性多肽研究與開發，人參皂甙，紫杉醇等生物活性成分研究與開發.

⑸ 單克隆抗體製備：包括診斷用單克隆抗體，治療用單克隆抗體.

基礎研究

⑴ 藥物作用機理

⑵ 基因功能

⑶ 疾病發生機理

2，生物製藥

⑴ 疫苗生產：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗，愛滋病疫苗等），腫瘤疫苗（多肽疫苗）等.

⑵ 基因工程藥物生產：如在臨床醫學中具有治療價值的一些細胞生長因子如干擾素，粒細胞生長因子，胸腺肽等 ⑶ 診斷用和藥用單克隆抗體生產

⑷ 細胞工程藥物生產：生物細胞內的一些生物活性多肽，生物活性物質等

細胞培養基本條件

1，合適的細胞培養基

合適的細胞培養基是體外細胞生長增殖的最重要的條件之一，培養基不僅提供細胞營養 和促使細胞生長增殖的基礎物質，而且還提供培養細胞生長和繁殖的生存環境.

2，優質血清

目前，大多數合成培養基都需要添加血清.血清是細胞培養液中最重要的成分之一，含有細胞生長所需的多種生長因子及其它營養成分.

3，無菌無毒細胞培養環境

無菌無毒的操作環境和培養環境是保證細胞在體外培養成功的首要條件.在體外培養 的細胞由於缺乏對微生物和有毒物的防禦能力，一旦被微生物或有毒物質污染，或者自身代謝物質積累，可導致細胞中毒死亡.因此，在體外培養細胞時，必須保持細胞生存環境無菌無毒，及時清除細胞代謝產物.

4，恆定的細胞生長溫度

維持培養細胞旺盛生長，必須有恆定適宜的溫度.

5，合適的氣體環境

氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳. 細胞培養基種類與基本成分 細胞培養基的種類很多，按其來源分為合成培養基和天然培養基（目前使用的培養基絕大部分是合成培養基）,按其物質狀態分為乾粉培養基和液體培養基兩類.乾粉培養基需由實驗者自己配製並滅菌，液體培養基由專業商家提供，用戶可直接使用，非常方便.每種細胞都有其合適的培養基，

主要成分

胺基酸

胺基酸是組成蛋白質的基本單位.不同種類的細胞對胺基酸的要求各異，但有幾種胺基酸細胞自身不能合成，必須依靠培養液提供，這幾種胺基酸稱為必需胺基酸.其中谷氨醯胺是細胞合成核酸和蛋白質必需的胺基酸，在缺少谷氨醯胺時，細胞生長不良而死亡.因此，各種培養液中都有較大量的谷氨醯胺.但是，由於谷氨醯胺在溶液中很不穩定，應置於-20℃冰櫃中保存，在使用前加入培養液內.已含谷氨醯胺的培養液在4℃冰櫃中儲存2周以上時，還應重新加入原來量的谷氨醯胺.

碳水化合物

碳水化合物是細胞生長主要能量來源，其中有的是合成蛋白質和核酸的成分.主要有葡萄糖，核糖，脫氧核糖，丙酮酸鈉和醋酸等.

無機鹽

培養液中無機鹽的主要功能是幫助細胞維持滲透壓平衡.此外，通過提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細胞調節細胞膜功能.培養液的滲透壓是一個非常重要的因素，細胞通常可耐受260mOsm/kg 320 mOsm/kg.標準培養液的滲透壓在此範圍內波動.特別注意：向培養液中加入其它物質有可能會明顯改變培養液的滲透壓，特別是溶於強酸或強鹼中的物質.向培養液中添加HEPES時需按以下方法調節鈉離子濃度.

緩衝系統

大多數細胞所需pH 在 7.2 - 7.4.但是，細胞培養最適pH值隨培養的細胞種類不同而不同.成纖維細胞喜歡較高pH （7.4 - 7.7），而傳代轉化細胞系則需要偏酸pH （7.0 - 7.4）.由於多數培養液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2體系進行緩衝，因此，氣相中的CO2濃度應與培養液中碳酸氫鈉濃度相平衡.如果氣相或培養箱空氣中CO2濃度設定在5%，培養3液中NaHCO3的加入量為1.97g/L；如果CO2濃度維持在10%，培養液中NaHCO3的加入

量為3.95g/L.細胞培養瓶蓋不應擰得太緊，以保證氣體交換. HEPES 是一種非離子緩衝液，在pH 7.2 - 7.4 範圍內具有較好的緩衝能力,但是非常昂貴，在高濃度時對一些細胞可能有毒.HEPES緩衝液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES引起的滲透壓增加.在這種培養條件下，細胞培養瓶的蓋子應擰緊，以防止培養液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中.大多數培養液中含有酚紅作為pH指示劑，酸性培養液呈橙黃色，鹼性培養液呈深紅色.

維生素

在細胞培養中，儘管血清是維生素重要來源，但是許多培養基中添加了各種維生素以適合更多的細胞系生長.

其它成分

在一些較為複雜的培養液中還包括其它一些成分.如在雜交瘤技術中常用的DMEM培養液，使用時還需要補加丙酮酸鈉和2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol,2-Me).2-Me 對細胞生長有很重要的作用.有人認為它相當於胎牛血清，有直接刺激細胞增殖作用.2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導細胞的增殖，為非特異性的激活作用.同時避免過氧化物對培養細胞的損害.另一個重要作用是促進分裂原的反應和DNA合成，增加植物凝集素（PHA）對淋巴細胞的轉化作用，已廣泛套用於雜交瘤技術，另外，也開始用於一些難以培養的細胞.2-Me是一種小分子還原劑，極易氧化.分子量為78.13，純的2-Me是一種無色有刺激味的液體，比重為1.110-1.120(Do20），常用終濃度為5×10-5M.常配製成0.1M的儲存液，用時每升培養液加0.5ml.

液體培養基保存

液體培養基應於4℃冰櫃避光保存，實驗前放入37℃預熱.未加血清液體培養基有效期為12個月.液體培養基中的L-谷氨醯胺會隨著儲存時間的延長而慢慢分解.如果細胞生長不良，可以再添加適量L-谷氨醯胺. 乾粉培養基保存：4℃冰櫃避光保存，有效期36個月.

血清

細胞培養液中添加的血清有牛血清，馬血清，人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清.胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價格昂貴.新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來的血清，如廠家能做到這一點，新生小牛血清的質量與胎牛血清的質量相差不大.如小牛出生後已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質，其質量明顯不如前兩種. 血清的質量，種類及使用的濃度都有可能影響細胞的生長，而不同批次的血清支持細胞生長的能力也不同，尤其是對克隆細胞的生長，某些批次血清可能含有毒性或抑制細胞生長的物質.因此，在購買大量血清之前，必須對血清支持細胞生長能力進行檢測,然後再，然後大量購買質量好的同一批號的血清，並注意以下幾點：

⑴需要長期保存的血清必須儲存於-20℃ - 70℃ 低溫冰櫃中.4℃冰櫃中保存時間切勿超過1個月.由於血清結冰時體積會增加約10%，因此，血清在凍入低溫冰櫃前，必須預留一定體積空間，否則易發生污染或玻璃瓶凍裂.

⑵一般廠商提供的血清為無菌，無需再過濾除菌.如發現血清有懸浮物，則可將血清加入培養液內一起過濾，切勿直接過濾血清.

⑶瓶裝血清解凍需採用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰櫃中的血清放入4℃冰櫃中溶解1天.然後移入室溫，待全部溶解後再分裝.在溶解過程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉澱的發生.切勿直接將血清從-20℃進入37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝集而出現沉澱.

⑷熱滅活是指56℃，30分鐘加熱已完全解凍的血清.加熱過程中須規則搖晃均勻.此熱處理的目的是使血清中的補體成分（complement）滅活.除非必須，一般不建議作此熱處理，因為熱處理會造成血清沉澱物顯著增多，而且還會影響血清的質量.補體參與反應有：細胞毒作用，平滑肌細胞收縮，肥大細胞和血小板釋放組胺，增強吞噬作用，促進淋巴細胞和巨噬細胞發生化學趨化和活化.

⑸切勿將血清在37℃放置太久，否則血清會變得渾濁，同時血清中的有效成分會破會而影響血清質量.

⑹血清中的沉澱物

絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍後血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會影響血清本身的質量.可用離心3000rpm,5分鐘去除，也可不用處理. 顯微鏡下"小黑點":經過熱處理過的血清，沉澱物的形成會顯著增多.有些沉澱物在顯微鏡下觀察象"小黑點",常誤認為血清受污染.一般情況下，此小黑點不會影響細胞生長，但如果懷疑血清質量，則應立即停止使用，更換另一批號的血清.

細胞培養環境

1，實驗室設計

細胞培養是一種無菌操作技術，要求工作環境和條件必須保證無微生物污染和不受 其它有害因素的影響.細胞培養室和設計原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環境清潔，空氣清新，乾燥和無煙塵.細胞培養室的設計原則一般是無菌操作區設在室內較少走動的內側，常規操作和封閉培養於一室，而洗刷消毒在另一室.

2，常用設施及設備

⑴超淨工作檯：也稱淨化工作檯，分為側流式，直流式和外流式三大類.

⑵無菌操作間：一般由更衣間，緩衝間和操作間三部分組成.操作間放置淨化工作檯及二氧化碳培養箱，離心機，倒置顯微鏡等.緩衝間可放置電冰櫃，冷藏器及消毒好的無菌物品等.

⑶操作間：普通培養箱，離心機，水浴鍋，定時鐘，普通天平及日常分析處理物

⑷洗刷消毒間：烤箱，消毒鍋，蒸餾水處理器及酸缸等.

⑸分析間：顯微鏡，計算機及印表機等.

3，培養器皿

常用細胞培養器皿有培養瓶，培養板，培養皿等.常準備量是使用量的三倍.器 皿應選擇透明度好，無毒，利於細胞粘附和生長的材料，常用一次性聚苯乙烯材料製品或中性硬度玻璃製品.常用的器皿有下面幾種.

⑴液體儲存瓶：用於儲存各種配製好的培養液,血清等液體，常用規格有500ml,250ml,100ml等幾種.

⑵培養瓶：根據培養細胞種類要求不同培養瓶的形態各異，用於細胞傳代培養的細胞要求瓶壁厚簿均勻，便於細胞貼壁生長和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小於1cm，允許吸管伸入瓶內任何部位，規格有200ml,100ml,50ml,25ml,10ml等幾種.

⑶培養皿：用於開放式培養及其它用途.分直徑30mm,60mm,120mm等幾種.

⑷吸管：常用的有長吸管和短吸管兩類，長吸管也稱刻度吸管.其改良後管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用於移動液體.常用1ml和10ml兩種.短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種.

⑸離心管：離心管是細胞培養中使用最廣泛的器皿，根據用途不同形態各樣，常用於細胞培養的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類.前者分別為50ml,30ml,15ml；後者則多為10ml和5ml.

⑹其它：如三角燒瓶，燒杯，量筒，漏斗，注射器等.

4，細胞培養溫度

維持培養細胞旺盛生長，必須有恆定而適宜的溫度.不同種類的細胞對培養溫度要求也不同.人體細胞培養的標準溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度範圍，細胞的正常代謝會受到影響，甚至死亡.培養細胞對低溫的耐受力較對高溫強，溫度上升不超過39℃時，細胞代謝與溫度成正比；人體細胞在39-40℃1小時，即能受到一定損傷，但仍有

可能恢復；在40-41℃1小時，細胞會普遍受到損傷，僅小半數有可能恢復；41-42℃1小時，細胞受到嚴重損傷，大部分細胞死亡，個別細胞仍有恢復可能；當溫度在43℃以上1小時，細胞全部死亡.相反，溫度不低於0℃時，對細胞代謝雖有影響，但並無傷害作用；把細胞放入25-35℃時，細胞仍能生存和生長，但速度減慢；放在4℃數小時後，再回到37℃培養，細胞仍能繼續生長.細胞代謝隨溫度降低而減慢.當溫度降至冰點以下時，細胞可因胞質結冰受損而死亡.但是，如果向培養液中加入一定量的冷凍保護劑（二甲亞碸或甘油），可在深低溫下如-80℃或-196℃（液氮）長期保存.

5，合適的氣體環境

氣體是哺乳動物細胞培養生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳.氧氣參與三羧酸循環,產生供給細胞生長增殖的能量和合成細胞生長所需用的各種成分.開放培養時一般把細胞置於95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環境中.二氧化碳既是細胞代謝產物，也是細胞生長繁殖所需成分，它在細胞培養中的主要作用在於維持培養基的pH值.大多數細胞的適宜pH為7.2-7.4，偏離這一範圍對細胞培養將產生有害的影響.但細胞耐酸性比耐鹼性大一些，在偏酸環境中更利於細胞生長.但有一些細胞也喜歡偏鹼環境中生長，如成纖維細胞最適合pH是7.4-7.6.每種細胞都有其最適pH值.

基本技術

無菌操作技術分為三個部分：工作環境及表面的處理，細胞培養所用玻璃及塑膠製品的處理及培養液與培養細胞的處理.

工作環境的處理

使用層流超淨工作檯是最經濟有效的手段.超淨工作檯正常工作時，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進入超淨台.

⑴實驗前，無菌室及無菌操作台用紫外燈照射30-60分鐘滅菌，用70% 酒精擦拭無菌操作台面，並開啟無菌操作颱風機運轉10分鐘後，才可開始實驗操作.每次操作只處理一株細胞，以免造成細胞交叉污染.實驗結束後，將實驗物品帶出工作檯.如需要繼續進行下一個實驗，則用70% 酒精擦拭無菌操作台面，再讓無菌操作颱風機運轉10分鐘後，才可進行下一個實驗操作.

⑵無菌操作工作區域應保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架，移液器或吸管頭等可以暫時放置，其它實驗用品用完後應及時移出，以利氣體流通.實驗用品要用70%酒精擦拭後才能帶入無菌操作台內.實驗操作應在操作台中央無菌區域內進行，勿在邊緣非無菌區域操作.

⑶小心取出無菌實驗用品，避免造成污染.切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開的容器正上方操作實驗.容器打開後，用手夾住瓶蓋並握住瓶身，傾斜約45°角取用，儘量勿將瓶蓋蓋口朝上放在檯面上.

⑷工作人員應注意自身的安全，必須穿戴實驗衣與手套後才進行實驗.對於來自人源性或病毒感染的細胞株應特別小心，並選擇適當等級的無菌操作台（至少兩級）.操作過程中，應避免引起氣溶膠的產生，小心有毒性試劑,例如DMSO及TPA等，並避免尖銳物品傷人等.

⑸定期檢查下列項目：CO2鋼瓶內的CO2壓力；CO2培養箱內的CO2濃度，溫度，及水盤是否有污染；無菌操作台內氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA過濾器濾膜，預濾網（300小時/預濾網，3000小時/HEPA). 培養細胞生長過程：潛伏期→指數增生期→停滯期 潛伏期（latent phase) 細胞接種後，先經過一個在培養液中呈懸浮狀態的懸浮期.此時，細胞質回縮，胞體呈圓球形.然後細胞貼附於載體表面，稱貼壁，懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類，培養基成分，載體的理化性質等密切相關.一般情況下，原代培養細胞貼壁速度慢，可達10-24小時或更多，而傳代細胞系貼壁速度快，通常10-30分鐘即可貼壁.細胞貼壁後還需經過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期.原代培養細胞潛伏期長，約24-96小時或更長，連續細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需6-24小時.

⑵ 指數增生期（logarithmic growth phase)

這是細胞增殖最旺盛的階段，分裂相細胞增多.指數增生期細胞分裂相數量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標誌.通常以細胞分裂相指數（Mitotic index,MI）表示，即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數.一般細胞的分裂指數介於0.1%-0.5%，原代細胞分裂指數較低，而連續細胞和腫瘤細胞分裂相指數可高達3%-5%.指數增生期的細胞活力最好時期，是進行各種實驗最佳時期，也是凍存細胞的最好時機.在接種細胞數量適宜情況下，指數增生期持續3-5天后，隨著細胞數量不斷增多，生長空間減少，最後細胞相互接觸匯合成片.正常細胞相互接觸後能抑制細胞運動，這種現象稱接觸抑制現象（contact inhibition).而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現象，能繼續移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發生堆積（piled up).細胞接觸匯合成片後，雖然發生接觸抑制，但只要營養充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數仍然在增多.但是，當細胞密度進一步增大，培養液中營養成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養枯竭和代謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現象稱密度抑制現象（Density Inhibition).

⑶停滯期（Stagnate phase)

細胞數量達到飽和密度後，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期.此時細胞數持平，故也稱平台期（Plateau phase).停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動.如不進行分離傳代，細胞會因培養液中營養耗盡，代謝產物積聚，pH下降等因素中毒,出現形態改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發生死亡，因此，應及時傳代. 培養細胞基本形態 培養細胞隨貼附支持物形狀不同而形態各異，最常見的是貼附於平面支持物細胞.在一般光鏡下生存中的細胞是均質而透明的，結構不明顯.細胞在生長期常有1-2個核仁.在細胞機能狀態不良時，細胞輪廓會增強，反差增大.若胞質中時而出現顆粒，脫滴和腔泡等，表明細胞代謝不良. 體外培養細胞根據它們在培養器皿是否能貼附於支持物上生長特徵，可分為貼附型生長和懸浮型生長兩大類.貼附型細胞在培養時能貼附在支持物表面生長.如羊水細胞為貼附型細胞，常表現為成纖維型細胞和上皮細胞生長.懸浮型細胞在培養中懸浮生長.

⑴成纖維型細胞

在培養中的細胞凡形態與成纖維細胞類似時，皆可稱之為成纖維細胞.本型細胞由形態與體內成纖維細胞的形態相似而得名，細胞在支持物表面呈梭形或不規則三角形生長，細胞中央有卵園形核，胞質向外伸出2-3厘米個長短不同的突起，除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間質起源的組織細胞常呈本類形態生長.

⑵上皮型細胞

此類型細胞在培養器皿支持物上生長具有扁平不規則多角形特徵，細胞中央有園形核，細胞緊密相連單層膜樣生長.起源於內，外胚層細胞如皮膚，表皮衍生物，消化管上皮等組織細胞培養時，皆呈上皮型形態生長.

⑶遊走型細胞

本型細胞在支持物上散在生長，一般不連成片.細胞質經常伸出偽足或突起，呈活躍的遊走或變形運動，速度快且不規則.此型細胞不很穩定，有時亦難和其它型細胞區別.在一定的條件下，由於細胞密度增大聯成片後，可呈類似多角型或成纖維細膩包形態.常見於羊水細胞培養的早期. 細胞培養所用玻璃及塑膠製品的清洗與消毒

清洗

在組織細胞培養中，體外細胞對任何有害物質都非常敏感.微生物產品附帶雜物,上次細胞殘留物及非營養成分的化學物質，均能影響培養細胞的生長.因此對新使用玻璃器皿和重新使用的培養器皿都要嚴格徹底的清洗，且要根據器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法.

玻璃器皿的清洗

組織細胞培養中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗.一般玻璃器皿的清洗包括浸泡，刷洗，浸酸和沖洗四個步驟.清洗後的玻璃器皿不僅要求乾淨透明無油跡，而且不能殘留任何物質.

⑴浸泡：初次使用和培養使用後的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉.新的初次使用的玻璃器皿，在生產及運輸過程中，玻璃表面帶有大量的乾固的灰塵，且玻璃表面常呈鹼性及帶有一些對細胞有害的物質等.新瓶使用前應先用自來水簡單刷洗，然後用稀鹽酸液浸泡過夜，以中和其中的鹼性物質.再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過的蛋白質，乾固後不易洗掉，故用後要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上.

⑵刷洗:浸泡後的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質.刷洗要適度，過度會損害器皿表面光澤度.

⑶浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀，濃硫酸和蒸餾水按一定比例配製而成，其處理過程稱為浸酸.清潔液對玻璃器皿無腐蝕作用，而其強氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質.清潔液去污能力很強.是清洗過程中關鍵的一環.浸泡時器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面.浸泡時間一般為過夜，不應少於6小時. 清潔液可根據需要，配製成不同的強度，常用的下列三種： 重鉻酸鉀（g) 濃硫酸（ml) 蒸餾水(ml) (A）強清潔液 63:1000:200000 (B）次強清洗液 120:200:1000 (C）弱清潔液 100:100:100. 清潔液配製時應注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，並要保護好面部及身體裸露部分.配製過程中可使重鉻酸鉀溶於水中，然後慢慢加濃硫酸.並不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發,配製過程中可使重鉻酸鉀溶於水中，然後慢慢加濃硫酸.並不停的用玻璃棒攪拌，使產生的熱量揮發，配製溶液應選擇塑膠製品.配成後清潔液一般為棕紅色.

⑷沖洗：玻璃器皿在使用後，刷洗及浸泡後都必須用水充分沖洗.使之儘量不留污染或潔液的殘跡.沖洗最好用洗滌裝置.即省力，效果又好.如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒乾淨，最好用蒸餾水清洗3-5次，晾乾備用.

膠塞的清洗

細胞培養中所用的橡膠製品主要是瓶塞.新購置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質，應先用自來水沖洗，再做常規處理，常規清洗方法是：每次用後立即置入水中浸泡，然後用2% NaOH或洗衣粉煮沸10-20分鐘，以除掉培養中的蛋白質.自來水沖洗後，再用1%稀鹽酸浸泡30分鐘或蒸餾水沖洗後再煮沸10-20分鐘，晾乾備用.

塑膠製品的清洗

塑膠自製品現多是採用無毒並已經特殊處理的包裝，打開包裝即可用，多為一次性物品.必要時用2% NaOH浸泡過夜，用自來水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30分鐘，最後用自來水和蒸餾水沖洗乾淨，晾乾備用.

消毒

細胞培養的最大危險是發生培養物的細菌，真菌和病毒等微生物的污染.污染主要是由於操作者的疏忽而引起，常見的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養器皿和培養液消毒不合格或不徹底.由於有關培養的每個環節的失誤均能導致培養失敗，故細胞培養的每個環節都應嚴格遵守操作常規，防止發生污染. 消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線，濕熱，乾烤，過濾等），化學滅菌法（各種化學消毒劑）和抗生素.

⑴紫外線消毒：用於空氣,操作台表面和不能使用其它法進行消毒和培養器皿.紫外線直接照射方便，效果好，經一定的時間照射後，可以消滅空氣中大部分細菌，培養室紫外線燈應距地面不超過2.5米，且消毒進物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用.紫外線可產生臭氧，污染空氣，試劑及培養液都有不良影響，對人皮膚也有傷害，不宜近照射.

⑵溫熱消毒：即高壓蒸氣消毒，是一種使用最廣泛，效果最好的消毒方法.溫熱消毒時，消毒物品不能裝得過滿，以防止消毒器內氣體阻塞而千百萬危險，保證其內氣體的流通.在加熱升壓之前，先要打開排氣閥門排放消毒器內的冷空氣，冷氣空氣排出後，關閉排氣閥門，同時檢驗安全閥活動自如，繼後開始升壓，當達到所需壓力時，開始記算消毒時間.消毒過程中，操作者不能離開工作崗位，要定時檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發生.

常用物品消毒壓力及時間：

培養液，平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃，15磅，20分鐘； 布類，玻璃製品，金屬器械等物品：先121℃，15磅,20分鐘，然後在烘箱中烘乾； 玻璃瓶：乾熱滅菌170℃，4小時.

⑶化學消毒法：最常見的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用於操作者的皮膚，操作台表面及無菌室內的壁面處理.後者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒.化學消毒法操作簡單，方便有效.

⑷抗生素消毒：主要用於培養用液滅菌或預防培養物污染. 細胞培養常用物品

細胞培養基

目前，市場上可提供乾粉培養基和液體培養基.乾粉培養基需使用者自己配製並滅菌，其優點是價格便宜.缺點是配製過程繁瑣，質量不易控制.液體培養基是由專業產家按標準規模化生產，不僅質量得到保證，而且使用十分方便.常用的培養基種類及其套用見下表：

培養基種類 套用細胞

RPMI-1640（標準型） 主要用於懸浮細胞培養

DMEM-高糖（標準型）

DMEM-低糖（標準型）

IMDM

McCoys 5A

M199

F10

血清

平衡鹽液體

PBS(Phosphate-Buffered Sallines)

DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Sallines）標準型

成分 含量（g/L)

CaCl2(anhyd.）（無水氯化鈣） 0.10

KCl 0.20

KH2PO4 0.20

MgCl2 6H2O 0.10

NaCl 8.00

Na2HPO4 7H2O 2.16

Hanks' 平衡鹽溶液（Hanks' Balanced Salt Solutions,HBSS)

成分 含量（g/L)

CaCl2(anhyd.）（無水氯化鈣） 0.14

KCl 0.40

KH2PO4 0.06

MgCl2 6H2O 0.10

11

MgSO4 7H2O 0.10

NaCl 8.00

NaCO3 0.35

Na2HPO4 0.048

D-Glucose 1.00

Phenol Red 0.01

D-Hanks' 平衡鹽溶液 (D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)

成分 含量（g/L)

KCl 0.40

KH2PO4 0.06

NaCl 8.00

NaCO3 0.35

Na2HPO4 0.048

D-Glucose 1.00

Phenol Red 0.01

消化液:

分離組織和分散細胞.常用的有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二鈉（EDTA）兩種溶液.可以單獨使用，也可以混合使用.

⑴胰蛋白酶溶液

胰蛋白酶（簡稱胰酶）是一種黃白色粉末，易潮解，應放置冷暗乾燥處保存.目前套用的胰蛋白酶主要來自牛或豬的胰腺.胰酶的主要作用是使細胞間的蛋白質水解，使細胞相互離散.胰酶對細胞的分離作用與細胞的種類和細胞的特性有密切關係.一般來講，胰酶濃度大，作用溫度高，作用時間長，對細胞分離能力也大，但超過一定的限度會損傷細胞.胰酶溶液在pH8.0，溫度為37℃時，作用能力最強.注意：鈣離子，鎂離子和血清蛋白的存在會降低胰酶活力.因此，胰酶溶液常用無Ca2+,Mg2+的D-Hanks' 平衡鹽溶液配製成0.25%溶液.消化細胞時，加入一些血清或含血清的培養液，或胰蛋白酶抑制劑能終止胰蛋白酶對細胞的消化作用.

胰蛋白酶溶液配製:

⑴稱取胰蛋白酶粉末置燒杯中，先用少許D-Hanks平衡鹽溶液（pH7.2左右）調成糊狀，然後再補足D-Hanks平衡鹽溶液，攪拌混勻，置室溫4小時或冰櫃過夜，並不斷攪拌振盪；

⑵次日，先用濾紙粗濾，再進行過濾除菌，分裝入瓶中，低溫冰櫃保存備用，常用濃度為0.25% 或0.125%.胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可調用碳酸氫鈉溶液調pH至7.2左右.

保存條件：配製好的胰蛋白酶溶液必須保存在-20℃冰櫃中，以免分解失效.

EDTA 4Na溶液

EDTA是一種化學螯合劑，對細胞有一定的離觧作用，而且毒性小，價格低廉，使用方便.常用工作液濃度為0.02%.通常與0.25%的胰蛋白酶溶液按1:1混合使用（混合液）.注意：使用EDTA處理細胞後，一定要用Hanks液沖洗乾淨，因殘留的EDTA會影響細胞生長. EDTA溶液配製：用無鈣，鎂的D-HBSS平衡鹽溶液溶解後，高壓蒸汽滅菌，分裝成小瓶，室溫或4℃冰櫃保存. 胰蛋白酶–EDTA 4Na溶液（0.05%胰蛋白酶，0.53mM EDTA 4Na)

0.5g胰蛋白酶+0.2gEDTA 4Na+1L D-HBSS.-20℃冰櫃中保存.

pH調整液

⑴NaHCO3溶液

常用濃度為7.5%.配製時用三蒸水溶解後，過濾除菌，分裝，4℃冰櫃或室溫保存.當pH值超過後，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或通入CO2氣體方法調節.

⑵HEPES（分子量238.31）溶液

HEPES使用終濃度一般為10-50mM，但通常配成1M儲存液：用200ml雙蒸水溶解47.6克HEPES，用1N NaOH 調節pH至7.5-8.0；然後過濾除菌,分裝小瓶，室溫或4℃保存. 抗生素溶液

酚紅：

大多數培養液中使用酚紅作為pH指示劑.紅色表示中性pH，黃色代表酸性pH，紫色表示鹼性pH.但是，在一些特殊培養液中不含酚紅，因為已有一些研究表明：酚紅能模擬類固醇激素（尤其是雌激素）樣作用.

丙酮酸鈉：

是細胞液中細胞的另一種碳源.D-葡萄糖是細胞優選碳源，但是當培養液中D-葡萄糖耗盡時，細胞可以代謝丙酮酸鈉獲取碳源.

抗生素

哺乳動物細胞冷凍保存

主要目的：⑴保存種子細胞，以便隨時取用.這是保存細胞的最主要目的.

⑵減少細胞被微生物污染的危險性.

⑶減少細胞之間交叉污染的危險性.

⑷減少細胞因傳代培養而引起的遺傳變異和形態改變.

⑸避免有限細胞系出現衰老或惡性轉化.

⑹ 降低人力和物力.

冷凍保存要點

⑴冷凍過程要緩慢.需要冷凍保存的細胞先在4℃冰櫃中放置 30-60分鐘；然後轉入-20℃，放置30分鐘；然後再轉入-80℃放置16-18小時（或過夜）；最後放入液氮中長期保存.有條件的地方，可用程控降溫儀，按每分鐘-1 到 -3℃速度降溫，一直到-80℃以下，然後直接放入液氮中長期保存.

⑵凍存細胞必須處在對數生長期，活力大於90%，無微生物污染.

⑶細胞濃度控制在：1×107-5×107/ml.

⑷使用高濃度血清或蛋白保護劑.一般情況下，用於冷凍保存完全細胞生長培養液中血清濃度大於20%.

⑸使用合適的細胞冷凍保護劑，以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞.目前，最常用的冷凍保護劑是DMSO（二甲基亞碸），使用終濃度為5-10%.但是，有些細胞系不能用DMSO作為冷凍保護劑，如人白血病細胞系HL-60.因為，DMSO能誘導HL-60細胞分化.在這種情況下，可選用其它冷凍保護劑，如甘油（glycele），羥乙基澱粉等.

特別注意：

⑴細胞在冷凍過程中在-20℃冰櫃內放置時間不可超過1小時，以防止冰晶過大而破壞細胞.也可跳過-20℃這一步驟直接放入-80℃冰櫃中，但這樣做細胞存活率要低一些.

⑵DMSO稀釋時會釋放大量熱量.因此，DMSO不能直接加到細胞液中，必須事先配製.

⑶DMSO 必須是細胞培養級別的.新買的DMSO本身處於無菌狀態，第一次開瓶後應立即少量分裝於無菌試管或瓶中，4℃保存.避免反覆凍融造成DMSO裂解產生有害物質.並可減少污染機會.如要過濾DMSO,必須選用耐DMSO的尼龍濾膜. 細胞冷凍保存液主要成分：冷凍保護劑，基礎培養液，血清或蛋白.

常用細胞冷凍保存液：

⑴10%DMSO + 完全細胞生長培養液（20%血清+基礎培養液）

⑵10%甘油 + 完全細胞生長培養液（20%血清+基礎培養液）

懸浮細胞冷凍保存操作程式（液氮保存法）：

⑴取對數生長期細胞培養物，離心200-400g 5分鐘.用 粘附（貼壁）細胞冷凍保存操作程式（液氮保存法）：

冷凍保存細胞的解凍與復甦要點：

⑴快速解凍.凍存細胞從液氮中取出後，應立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1分鐘內全部融化（不要超過3分鐘）.

⑵解凍操作過程動作要輕.由於冷凍保存過的細胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動作要輕.一般情況下，解凍後的細胞可直接接種到含完全生長培養液的細胞培養瓶中直接進行培養（1ml 凍存細胞液加入到25-30ml新鮮完全培養液中），24小時後再用新鮮完全培養替換舊培養液，以去除DMSO.如果，細胞對冷凍保護劑特別敏感，那么，解凍後的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然後再接種到含完全生長培養液的培養瓶中.

特別注意：

⑴解凍時務必注意安全，預防冷凍管爆裂.，要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，放入37℃水浴中.切不可直接用手，以免凍傷.

⑵冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發生污染.

解凍冷凍保存細胞的離心方法：

⑴從液氮中取出凍存的細胞，立即放入37℃水浴中快速解凍.

⑵將1-2ml 凍存細胞液加入到25ml新鮮完全細胞生長培養液中，輕輕混勻.

⑶用80g 離心2-3分鐘，棄上清液.

⑷用完全生長培養液輕輕懸浮細胞團，並計數細胞.

⑸接種細胞到培養瓶中，起始密度為3×105/ml.