天藍色鏈黴菌sigma因子SigT的調控機制研究

《天藍色鏈黴菌sigma因子SigT的調控機制研究》是依託浙江大學，由李永泉擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：天藍色鏈黴菌sigma因子SigT的調控機制研究
• 依託單位：浙江大學
• 項目負責人：李永泉
• 項目類別：面上項目

項目摘要

天藍色鏈黴菌含數量眾多的ECF sigma因子，在環境脅迫應答、形態改變、初級和次生代謝轉換等過程中發揮重要的轉錄開關作用。對其中SigT所在的操縱子研究發現sigT和其抗sigma因子rstA的缺失株同時表現分化加快，抗sigma因子RstA對SigT蛋白穩定性是必需的，並發現了SigT潛在的抗抗sigma因子RstB，提示可能存在一個全新的抗sigma因子調控機制。. 本課題將綜合運用生物信息學、蛋白質免疫共沉澱、體外轉錄分析、分子活體影像、蛋白磷酸化、DNA-蛋白質相互作用等技術，系統研究sigT的結構功能、轉錄活性調控、亞細胞定位和對下游基因的轉錄調控網路,闡述SigT操縱子在天藍鏈黴菌形態分化、環境脅迫應答和次生代謝過程中的作用，進一步闡明ECF家族sigma因子在鏈黴菌多種複雜生命活動中新的調控機制，為系統解析鏈黴菌sigma因子調控網路提供基礎。

結題摘要

已超額完成了計畫書規定的任務，在JBC、AEM、JB、AMB等領域著名刊物發表8篇較高質量的SCI論文，闡述了σ因子穩定性與細胞分化的相互調控關係，深刻揭示了σ因子在體內的降解機制及其生物學意義。首先發現了天藍色鏈黴菌中SigT蛋白在敲除rstA突變體中消失，表明抗σ因子RstA對於SigT的潛在獨特調控機制。通過構建組成型高表達高拷貝穿梭質粒，發現不同的生理條件下SigT可調節次級代謝過程，表明SigT回響了環境信號選擇性介導不同靶基因的表達來調控細胞分化。研究表明sigT敲除缺失株在磷酸鹽脅迫下，抗生素Act和Red產生提前，且產量提高；在氮源脅迫時，sigT敲除缺失株的抗生素產量明顯低於野生型，顯示SigT對次級代謝具有正調控作用，RT-PCR分析表明SigT的表達受到氮源脅迫正向調控；轉錄分析發現，嚴謹回響相關的ppGpp合成酶基因relA和磷酸鹽轉運基因pstS受到SigT的正向調控，從而揭示了SigT在營養脅迫下對鏈黴菌次級代謝的調控作用。研究發現抗σ因子RstA能夠穩定SigT蛋白，即正調節SigT蛋白活性，而不是拮抗σ因子，與傳統的σ調控機制完全不同。SigT蛋白降解是通過體內ClpP/SsrA途徑進行的，SigT反過來能夠直接結合到clpP基因啟動子上負調控clpP/ssrA基因表達，次級代謝產物能夠破壞該結合，表明體記憶體在一個雙重正反饋調控機制來快速降解SigT蛋白，啟動細胞分化過程。胞內蛋白酶體在SigT的降解過程中也發揮重要作用，在rstA 敲除突變株中敲除蛋白酶體β/α亞基 (prcB/A)並不能回復SigT蛋白的穩定性，表明蛋白酶體的降解作用是間接效應；同時敲除prcB/A的缺失株抗生素產量下調，而過表達redD或actII-orf4則能促進prcB/A敲除缺失株中SigT蛋白的降解，表明蛋白酶體影響次級代謝產物的合成，再通過雙重正反饋機制來調節SigT蛋白穩定性。綜上所述，抗σ因子RstA是SigT蛋白穩定的必要條件，RstA蛋白被降解後，導致了ClpP/SsrA依賴性的SigT蛋白以一種雙重正反饋調節模式被降解，次級代謝產物充當了適時和不可逆的細胞分化進程中SigT降解的調控因子。這一新機制加深了對於細胞元件協同作用維持轉錄調控因子適當蛋白質水平，以實現正常細胞發育和環境適應機制的認識。