大骨節病軟骨細胞代謝障礙途徑的調控基因及功能研究

《大骨節病軟骨細胞代謝障礙途徑的調控基因及功能研究》是依託西安交通大學，由王偉卓擔任項目負責人的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：大骨節病軟骨細胞代謝障礙途徑的調控基因及功能研究
• 項目類別：青年科學基金項目
• 項目負責人：王偉卓
• 依託單位：西安交通大學

項目摘要

針對大骨節病關節軟骨細胞代謝異常涉及途徑環節不明的關鍵問題，以前期全基因晶片篩選結果所獲大骨節病軟骨細胞損傷的差異基因表達譜分子生物學特徵為基礎，採用基於人軟骨樣本與基因功能研究相結合的方法，套用原位雜交、體外細胞培養、Western blot、RT-PCR等技術，從人體、細胞、基因、蛋白水平不同層次，首先對已得代謝異常密切相關PAPSS2、FABP4等基因基於人軟骨樣本的多層面篩選驗證，籍此為基準，構建聯合表達載體，體外轉染大骨節病和正常人關節軟骨細胞，利用RNAi目的基因功能研究技術檢測關節軟骨細胞基質蛋白、硫酸軟骨素、透明質酸酶等代謝途徑的干擾表達情況，力求從不同角度闡明關節軟骨代謝障礙途徑及其干擾效果，以此了解大骨節病軟骨代謝病變關鍵，更深層面探索軟骨慢性損害機理及防治途徑，為提高大骨節病早期診斷、早期預防的水平，提供新的科學依據。

結題摘要

目的：研究大骨節病差異基因功能，在骨與軟骨細胞中的作用及通路。方法：（1) 收集正常軟骨、大骨節病軟骨、骨關節炎軟骨通過免疫組化和免疫組化方法，對比研究骨關節炎、大骨節病、正常軟骨，及軟骨細胞細胞中差異基因表達情況；（2）從小鼠不同組織提取RNA，通過Real time PCR 研究選定基因在不同組織中的表達情況；（3）培養MC3T3細胞，RAW264.7，免疫組織化學，Western blot，Real time PCR觀察該基因在基因、蛋白、組織水平不同細胞種類表達情況；（4）通過構建低表達與高表達載體，shRNA慢病毒及逆轉錄病毒導軟骨與骨細胞，RNAi，檢測基因沉默、高表達或干預後骨細胞茜素紅染色和von Kossa染色鈣沉積、鹼性磷酸酶、成骨標誌及硫代謝相關等基因的表達情況。MC3T3-E1細胞的P-Smad2/3、ERK通路及TGF通路等蛋白的水平。（5）通過生物信息學分析，深入研究PAPSS2、FABP4、Collgen在骨與軟骨細胞代謝中的作用，探索KBD 軟骨損害途徑。結果：PAPSS2、FABP4、Col24a1 mRNA的表達在骨和成骨細胞分化過程中起的作用。成骨細胞高表達PAPSS2、FABP4、Col24a1促進成骨細胞的ALP活性和礦化。1型膠原蛋白和OPN的表達衰減，過度表達時增加。PAPSS2基因在骨關節炎、大骨節病中的高表達；PAPSS2、FABP4、Col24a1可以促進成骨細胞分化，促進成骨細胞鈣化，增加COL1和OPN表達。PAPSS2調節成骨細胞Smad通路，增強ALP活性和礦化,PAPSS2上游的OPN誘導行為，直接或間接調節OPN活性和成骨基因的表達。結論： PAPSS2、FABP4、Col24a1對正常的骨骼發育是非常重要與大骨節病骨骼發育異常密切相關。PAPSS2等沉默顯著抑制的Smad 2/3，TGF -β信號通路的關鍵轉錄因子的mRNA表達。Col24a1調節成骨細胞的ALP活性和細胞礦化，並通過TGF-β/Smads信號通路可能。PAPSS2通過ERK信號通路的促進ATDC5成軟骨細胞分化和基質形成。FABP4通過TGF-β信號途徑影響骨與軟骨生成發育，與BMP信號轉導途徑密切相關。