《夏威夷鏈黴菌及其用途》是湖北泱盛生物科技有限公司於2010年11月30日申請的發明專利，該專利申請號為2010105656521，公布號為CN102168035A，公布日為2011年8月31日，發明人是張衛元、郝勃、毛濤。
《夏威夷鏈黴菌及其用途》屬於生物技術領域，涉及一種夏威夷鏈黴菌，該微生物可用於發酵生產乙醯異戊醯泰樂菌素，且發酵時間短。採用連續流補加泰樂菌素，減少了底物抑制，促進了反應向正方向進行，使AIV的效價提升。且發酵時間為5天比2010年11月之前已有生產工藝縮短2天。採用連續流補加泰樂菌素，減少了底物抑制，促進了反應向正方向進行，使AIV的效價提升。該發明提供的夏威夷鏈黴菌的保藏名稱為夏威夷鏈黴菌武漢變種（Streptomyces hawaiiensis 0915），保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏日期：2010年10月16日；保藏號為CCTCCNO：M2010261。發酵過程中無論搖瓶發酵還是各類罐體發酵的周期均為5天，較報導的Streptomyces thermotolerans E1菌株的發酵時間均縮短了2天，Streptomyces hawaiiensis 0915 CCTCC NO：M2010261發酵結束後的效價為18.6毫克/毫升轉化效率高達90%，顯著高於顯著高於報導 Streptomyces thermotolerans。
2017年12月，《夏威夷鏈黴菌及其用途》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
（概述圖為《夏威夷鏈黴菌及其用途》摘要附圖）
基本介紹
- 中文名：夏威夷鏈黴菌及其用途
- 地址：湖北省孝感市應城開發區工業園橫一路
- 公布號：CN102168035A
- 公布日：2011年8月31日
- 申請號：2010105656521
- 申請日：2010年11月30日
- 申請人：湖北泱盛生物科技有限公司
- 發明人：張衛元、郝勃、毛濤
- 代理機構：武漢天力專利事務所
- 代理人：程祥、馮衛平
- 類別：發明專利
- Int. Cl.：C12N1/20（2006.01）I、C12P17/08（2006.01）I、C12R1/465（2006.01）N
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,附圖說明,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
（Tylosin）是一種畜禽專用抗生素，最早是由美國學者Hamill等1961年從泰國土壤中分離而得，產生菌有弗氏鏈黴菌（Streptomyces fradiae，NRR2702，2703），龜裂鏈黴菌（Streptomyces rimosns）和吸水鏈黴菌（Streptomyces hygroscopicus）。泰樂菌素的特點：
1.它具有顯著的抗支原體（霉形體）作用，對胸膜肺炎類支原體及其他多種支原體有很強的抑制作用，為畜禽支原體感染性疾病的首選藥物。
2.抗菌譜較廣，主要對多種革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，還對部分革蘭氏陰性菌、彎桿菌（過去歸屬弧菌）、螺旋體等有抑制作用，此外它還具有抗球蟲的作用。
3.吸收和排泄迅速，無論口服或注射，均能在很短時間內（數10分鐘）達到有效抑菌濃度並保持一定時間，停藥後迅速排出體外，在組織內幾乎無殘留。
4.具有良好的擴散能力，可滲透入所有器官、組織和體液，尤其是能通過漿性膜、血腦、血眼和血睪屏障，這就使得泰樂菌素在臨床治療上得到廣泛套用。
5.顯著的促生長作用，給生長期的畜禽連續低劑量飼用泰樂菌素，不僅能預防疾病，還能顯著促進動物生長，縮短生長周期，提高飼料報酬。
Tylosin在畜禽體記憶體在藥物殘留，再加之其與同屬大環內酯類抗生素的紅黴素（Erythromycin）等人用抗生素的結構有很大的相似性，有可能會使某些病原菌產生對某些人用大環內酯類抗生素（主要為紅黴素家族）的交叉抗性，2010年11月之前歐盟已經禁止了Tylosin作為飼料添加劑在畜禽養殖中的繼續使用，但隨著對泰樂菌素抑菌機理及化學結構與功能方面的進一步研究，各國已研製出許多泰樂菌素衍生物，其在抗菌效果、化學殘留、耐藥性等方面均表現出比泰樂菌素優越之處，其中乙醯異戊醯泰樂菌素（acetyl-isovaleryl tylosin，AIV）是一種受到廣泛關注的衍生物，它在抗菌和抗支原體上有很高活力，且對有耐藥性的支原體也有很好效果，因此它是一種具有很高工業套用價值的抗生素。AIV是是通過對Tylosin的3-OH乙醯基化和4”-OH異戊醯化而獲得。產生泰樂菌素的弗氏鏈黴菌等中並沒有能夠使產物泰樂菌素乙醯異戊醯基化的基因，可以利用耐熱鏈黴菌（Streptomyces thermotolerans）中的負責乙醯基化的acyA基因和負責異戊醯基化的acyB1-B2基因異源性表達而獲得AIV。2010年11月之前的生產用菌株是一種名為Streptomyces thermotoleransE1的基因工程菌，通過在其發酵液中添加泰樂菌素溶液而合成乙醯異戊醯泰樂菌素。擬申報的專利保護的對象是該公司篩選到的一株夏威夷鏈黴菌（Streptomyces hawaiiensis 0915），利用該菌株與報導的Streptomyces thermotolerans E1的基因工程菌一樣，能夠通過補加泰樂菌素的方式發酵AIV，並且其生產性能不亞於後者。
發明內容
專利目的
《夏威夷鏈黴菌及其用途》所要解決的問題是提供一種夏威夷鏈黴菌，該微生物可用於發酵生產乙醯異戊醯泰樂菌素，且發酵時間短。採用連續流補加泰樂菌素，減少了底物抑制，促進了反應向正方向進行，使AIV的效價提升。且發酵時間為5天比2010年11月之前已有生產工藝縮短2天。採用連續流補加泰樂菌素，減少了底物抑制，促進了反應向正方向進行，使AIV的效價提升。
技術方案
《夏威夷鏈黴菌及其用途》提供的夏威夷鏈黴菌的保藏名稱為夏威夷鏈黴菌武漢變種（Streptomyces hawaiiensis 0915），保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏地址：中國.武漢.武漢大學；保藏日期：2010年10月12日；保藏號為CCTCC NO：M2010261。
該發明夏威夷鏈黴菌（Streptomyces hawaiiensis 0915）生長較快，將菌種接種至種子培養基中，經過2天的發酵，在轉種至發酵罐中，培養2天后，補加泰樂菌素和L-亮氨酸混合溶液，在流加過程中通過補加檸檬酸調節ph值。
改善效果
發酵過程中無論搖瓶發酵還是各類罐體發酵的周期均為5天，較報導的Streptomyces thermotolerans E1菌株的發酵時間均縮短了2天，Streptomyces hawaiiensis 0915CCTCC NO：M2010261發酵結束後的效價為18.6毫克/毫升轉化效率高達90%，顯著高於報導Streptomyces thermotolerans。在夏威夷鏈黴菌的培養過程中，溫度對於菌體的生長和泰樂菌素的轉化起到了非常重要的作用。通過改變不同的培養條件，在27-35攝氏度的實驗過程中，改變不同的溫度可以看出，在較低的溫度下該菌株的轉化效率較高，在31攝氏度的情況下，可以檢測到最佳的轉化效率和較高的效價。
溫度（℃） | 效價（毫克/毫升） | 轉化效率（%） |
27 | 11.5 | 88 |
28 | 16.2 | 84 |
29 | 14.5 | 86 |
30 | 16.5 | 86 |
31 | 18.6 | 90 |
32 | 17.3 | 84 |
33 | 15.4 | 82 |
34 | 12.1 | 70 |
35 | 8.2 | 60 |
附圖說明
圖1為《夏威夷鏈黴菌及其用途》菌株在麥芽粉培養基Streptomyces hawaiiensis 0915的菌落形態；
圖2在油鏡下Streptomyces hawaiiensis 0915的菌絲形態；
圖3在油鏡下Streptomyces hawaiiensis 0915的革蘭氏染色。
權利要求
1.一種夏威夷鏈黴菌，其特徵在於：該微生物的保藏名稱為夏威夷鏈黴菌武漢變種（Streptomyces hawaiiensis 0915），保藏單位：中國典型培養物保藏中心；保藏日期：2010年10月16日；保藏號為CCTCCNO：M2010261。
2.權利要求1所述夏威夷鏈黴菌用於將泰樂菌素轉化為3-O-乙醯-4″-O-異戊醯泰樂菌素的用途。
實施方式
下面結合附圖對《夏威夷鏈黴菌及其用途》涉及的方法均為常規方法；所述試劑和生物材料，如物特殊說明，均可從商業途徑獲得。該發明菌株（Streptomyces hawaiiensis 0915）在28攝氏度條件下在高氏一號瓊脂培養基和麥芽粉培養基上均生長良好，培養5天后，開始出現清晰可見的單菌落，培養10天后生長茂盛，氣生菌絲肉色，基內菌絲肉色至黃褐色，單菌落有光澤，圓形，邊緣整齊，四周向中心聚集，菌落中心向上凸起。著生在一起的菌落呈褶皺狀。氣生菌絲與基內菌絲均為黃色，無可溶性色素產生（參見圖1，其中左圖為正面圖，右圖為背面圖）。在50攝氏度培養條件下沒有生長。
顯微鏡鏡下觀察發現，孢子絲柔曲，呈分枝狀，有的呈螺旋狀，孢子光滑呈圓形，沒有觀察到孢囊、孢核等結構（圖2），革蘭氏染色為陽性（圖3）。該發明菌株（Streptomyces hawaiiensis 0915）不能在50攝氏度以上的環境中生長，與耐熱鏈黴菌顯然不同；從菌落形態上來看，該發明菌株（Streptomyces hawaiiensis 0915）氣生菌絲為肉色，與耐熱鏈黴菌的綠色明顯不同。以鏈黴菌16SrDNA序列擴增的通用引物，PCR擴增得到菌株（Streptomyces hawaiiensis 0915）的16SrDNA序列，經測定獲得其序列長1789bp。將該序列通過NCBI網站進行BLAST相似性分析，得到相似性序列109個，除三種為非鏈黴菌屬外，其餘全屬於鏈黴菌屬。與該菌株16SrRNA序列相似性較高的見表1，其中相似性最大的為耐熱鏈黴菌（Streptomycesthermotolerans）、印度鏈孢子囊菌（Streptomycesindiaensis，原名為Streptosporangiumindianense）以及夏威夷鏈黴菌（Streptomyceshawaiiensis）。
結論：從細胞形態、培養特徵和16SrDNA的序列比對綜合判斷，該發明獲得的AIV轉化菌株為夏威夷鏈黴菌（Streptomyceshawaiiensis）。
該發明夏威夷鏈黴菌（Streptomyces hawaiiensis 0915）生長較快，無論是搖瓶發酵還是各類罐體發酵的周期均為5天，較報導的Streptomyces thermotolerans E1菌株的發酵時間均縮短了2天，並且發酵效價為18.6毫克/毫升，轉化效率高達90%，顯著高於報導Streptomycesthermotoleran。
1、菌株篩選：該公司科研人員從國內10個省份（採集時間是2006年2月，地點有湖北武漢，黃石，江陵，十堰，襄樊；湖南嶽陽，臨澧；廣東汕頭，湛江；江西九江，景德鎮；河北邯鄲，河南信陽，鄭州；廣西桂林；四川都江堰；福建龍巖；山東泰州等）採取了200分份土樣，從土樣中經過常規稀釋平板分離到1200個鏈黴菌菌株，將挑選菌種接種到發酵培養基中【發酵培養基成分克/升：可溶性澱粉40克，豆粕20克，酵母膏1克，七水硫酸鎂7.5克，磷酸氫二鉀0.5克蒸餾水1000毫升，分裝每250毫升三角瓶中裝30毫升發酵培養基，121攝氏度滅菌30分鐘】，經過48小時培養，培養條件為30攝氏度，200轉/分鐘。加入1.00毫升底物（底物成分摩爾比為:泰樂菌素:L-亮氨酸:葡萄糖=1:5:3），繼續培養72小時，培養結束後取1毫升菌液至試管中，加入5毫升甲醇終止反應。取上述液體過0.22微米膜後，等待液相分析。液相色譜條件為:色譜柱WatersHypersilODSC18，柱長250毫米，內徑4.6毫米，檢測波長280納米，流動相0.85摩爾/升高氯酸鈉-乙腈（1:1）（pH3.0），流速1.0毫升/分鐘，柱溫35攝氏度。檢測樣品中是否有與乙醯異戊醯泰樂菌素標準品出峰時間一致的峰，如果有的話，則初步判定為可以轉化生成乙醯異戊醯泰樂菌素。
其中58個菌株在搖瓶發酵過程中具有轉化泰樂菌素為AIV的能力。又經過目測和HPLC檢測，這58個菌株中僅4個不含可溶性色素並且不產生與泰樂菌素結構類似的大環內酯類抗生素。然後對這4個菌株進行亞硝基胍誘變，結果將其中的夏威夷鏈黴菌（Streptomyces hawaiiensis）胞內泰樂菌素水解酶（脂肪水解酶）基因去除，最後將含有乙醯化酶基因和異戊醯化基因的質粒轉化（導入）脂肪水解酶失活的夏威夷鏈黴菌菌株，經過HPLC檢驗，該夏威夷鏈黴菌轉化子（該發明菌株，即Streptomyces hawaiiensis 0915）。將Streptomyces hawaiiensis 0915接種至發酵培養基（按照表2配製發酵培養基），在31攝氏度，220轉/分鐘的條件下培養2天后，添加泰樂菌素和亮氨酸混合液（底物成分摩爾比為:泰樂菌素:L-亮氨酸=1:5），繼續培養三天然後檢測發酵液中AIV的含量。該菌株Streptomyces hawaiiensis 0915可將90%左右的泰樂菌素轉化為AIV，發酵效價（18.3毫克/毫升）顯著高於報導的耐熱鏈黴菌（Streptomyces thermotolerans）。
培養基 | 成分 | 含量（克） |
種子培養基 | 可溶性澱粉 | 10 |
豆粕 | 5 | |
七水硫酸鎂 | 0.5 | |
磷酸氫二鉀 | 0.5 | |
有機矽消沫劑 | 0.1 | |
蒸餾水 | 1000 | |
發酵培養基 | 可溶性澱粉 | 40 |
豆粕 | 20 | |
七水硫酸鎂 | 7.5 | |
酵母膏 | 1 | |
磷酸氫二鉀 | 0.5 | |
有機矽消沫劑 | 0.1 | |
蒸餾水 | 1000 |
2、發酵過程：試管菌種→→搖瓶菌種→→10L罐菌種→→100L罐菌種→→10T罐發酵→→添加泰樂菌素→→繼續發酵→→發酵後純化分離AIV其中菌種培養基按表2中種子培養基配製，發酵培養基按照表2中發酵培養基配製。
3、AIV的檢測：按照進口獸藥標準2006年版，分析鑑定AIV的含量。
榮譽表彰
2017年12月，《夏威夷鏈黴菌及其用途》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
