壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法

《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》是三九集團湛江開發區雙林藥業有限公司於2004年12月28日申請的專利，該專利的公布號為CN1670031，申請公布日為2005年9月21日，發明人是朱光祖、梅偉伶。

《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》包括以下步驟：A.分兩步調控血漿參數並沉澱，壓濾，得沉澱組分F123和上清液a；B.分兩步調節上清液a，沉澱，壓濾，得上清液b和沉澱；C.調節上清液b，沉澱，壓濾，收集沉澱物白蛋白FV；D.取沉澱組分F123溶解並調節參數，壓濾，得上清液c和沉澱；E.調節上清液c，沉澱，壓濾，收集沉澱物球蛋白F2。該發明通過調整血漿的pH值、溫度、蛋白濃度、離子強度、乙醇濃度和沉澱分離方式等條件，確定了有利於產品分離的參數值及沉澱分離步驟，使產品的收率進一步提高，使免疫球蛋白的收率升高至8克/千克血漿，破傷風抗體效價達到110IU/毫升。

2015年11月27日，《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。

（概述圖為《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》摘要附圖）

基本介紹

• 中文名：壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法
• 申請人：三九集團湛江開發區雙林藥業有限公司
• 申請日：2004年12月28日
• 申請號：2004100776930
• 公布號：CN1670031
• 公布日：2005年9月21日
• 發明人：朱光祖、梅偉伶
• 地址：廣東省湛江市海濱三路40號
• 分類號：C07K1/34、C07K14/435、C07K14/76
• 代理機構：廣州新諾專利商標事務所有限公司
• 代理人：羅毅萍
• 類別：發明專利

專利背景

從人血漿中分離蛋白質，經典方法是E.J.Cohn教授創立的低溫乙醇分級沉澱技術，分離血漿中的組分F1、F2（既免疫球蛋白）、F3、F4、F5（即白蛋白）。該技術通過有效控制蛋白質沉澱的五個因素：pH值、溫度、蛋白濃度、離子強度、乙醇濃度來逐級沉澱血漿中的不同蛋白質。

在低溫乙醇法分離血漿蛋白中，蛋白質沉澱分離的傳統方法採用連續冷凍離心機分離工藝，該工藝要求操作溫度保持低溫，對能源消耗大而且對操作員身體健康不利，該工藝是間歇式操作，期間容易發生操作人員和製品的直接接觸導致污染。因此離心分離工藝已經逐步被可封閉式連續操作的壓濾分離工藝所取代。

在已有的壓濾工藝中，從血漿中直接沉澱組分F1234製得的白蛋白，往往夾雜有不穩定蛋白質，不易在室溫保存；採用先沉澱組分F123，再沉澱組分F4製備白蛋白的方法也存在蛋白質收率較低的問題。

中國專利公開號1523038A，公開日2004年8月25日，發明名稱“一種血漿蛋白的分離方法”，該申請案公開了一種血漿蛋白的分離方法，通過調節血漿的pH值、離子強度、蛋白濃度、乙醇濃度和溫度，用加壓過濾的方式分離得到上清液和沉澱。根據該法所公開的上述各血漿溶液的參數，白蛋白產率達到2.8～3.0克/100毫升血漿，球蛋白產率達到0.55～0.70克/100毫升血漿。

發明內容

專利目的

該發明的目的在於提供一種既能高收率分離血漿蛋白、又能保持蛋白質穩定性，使其適於常溫保存的血漿蛋白的分離方法。

技術方案

《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》包括以下步驟：

（A）調控血漿參數：pH6.90～7.50，酒精濃度7～9％，溫度-3±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置2小時；調節pH6.50～7.10，酒精濃度18～22％，離子強度0.12～0.18，溫度-5±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置2小時；加入助濾劑，攪拌反應30分鐘，壓濾，得沉澱組分F123和上清液a；

（B）調節上清液a：pH5.00～5.50，酒精濃度16～20％，離子強度0.12～0.18，溫度-5±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時；調節：pH5.80～6.30，溫度-5±1.5℃，酒精濃度38～42％，離子強度0.12～0.18，攪拌反應30分鐘，靜置8小時；加入助濾劑，攪拌反應30分鐘，壓濾，收集上清液b和沉澱F4-1和F4-4；

（C）調節上清液b：pH4.05～5.25，酒精濃度18～22％，離子強度0.12～0.18，溫度-11±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置5小時，攪拌反應30分鐘，壓濾，收集沉澱物白蛋白FV；

（D）取沉澱組分F123溶解並調節離子強度至0.010～0.020，pH4.90～5.30，酒精濃度15～19％，溫度-5±1.5℃，攪拌反應30分鐘，壓濾，收集上清液c和沉澱F1；

（E）調節上清液c：pH7.20～7.60，酒精濃度23～27％，溫度-10±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時，壓濾，收集沉澱物球蛋白F2。

在以往的沉澱分離方法中，均採用先沉澱組分F123，再沉澱組分F4製備白蛋白的方式。由於沉澱組分F1與F2、3的等電點不同，因此三者同時沉澱會存在沉澱不完全的問題。而該發明採用了分步沉澱的方式，即先調控血漿參數為F1沉澱的最佳值使F1靜置分離，然後再次調整血漿參數使F2、3沉澱。這樣，F1與F2、3均可以較徹底地沉澱。沉澱量比一步沉澱法增加1.5～2倍。同理，由於沉澱組分F4-1與F4-4的等電點也有著較明顯的差距，因此也採用分步沉澱法使兩者分別沉澱，沉澱量同樣能增加1.5～2倍。

改善效果

《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》通過反覆多次的試驗，嘗試調整血漿的pH值、溫度、蛋白濃度、離子強度、乙醇濃度和沉澱分離方式等條件，確定了有利於產品分離的最佳pH值、及溫度，尤其確定了最有利於產物收率的沉澱分離步驟，使產品的收率進一步提高，使免疫球蛋白的收率從傳統的5克/千克血漿升高至8克/千克血漿，破傷風抗體效價達到110IU/毫升。同時，採用該發明可以顯著地改善生產環境，車間溫度可以控制在0℃以上。採用壓縮空氣做過濾動力，大大降低了離心分離的能耗，也降低了操作人員的勞動強度，從離心分離的開放性操作變為密閉性操作，減少人與製品的直接接觸，提高了安全性，降低了生產成本，具有顯著的經濟效益。

附圖說明

圖1是《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》的工藝流程圖。

附圖說明

權利要求

1、《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》包括以下步驟：

（A）調控血漿參數：pH6.90～7.50，酒精濃度7～9％，離子強度0.12～0.18，溫度-3±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置；調節pH6.50～7.10，酒精濃度18～22％，離子強度0.12～0.18，溫度-5±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置；加入助濾劑，攪拌反應30分鐘，壓濾，得沉澱組分（F123）和上清液（a）；

（B）調節上清液（a）：pH5.00～5.50，酒精濃度16～20％，離子強度0.12～0.18，溫度-5±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時；調節：pH5.80～6.30，酒精濃度38～42％，離子強度0.12～0.18，溫度-5±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置8小時；加入助濾劑，攪拌反應30分鐘，壓濾，得上清液（b）和沉澱（F4-1）和（F4-4）；

（C）調節上清液（b）：pH4.05～5.25，酒精濃度18～22％，離子強度0.12～0.18，溫度-11±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置5小時，攪拌反應30分鐘，壓濾，收集沉澱物白蛋白（FV）；

（D）取沉澱組分（F123）溶解並調節離子強度至0.010～0.020，pH4.90～5.30，酒精濃度15～19％，溫度-5±1.5℃，攪拌反應30分鐘，壓濾，得上清液（c）和沉澱（F1）；

（E）調節上清液（c）：pH7.20～7.60，酒精濃度23～27％，溫度-10±1.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時，壓濾，收集沉澱物球蛋白（F2）。

2、根據權利要求1所述的壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法，其特徵在於：

（A）調控血漿參數：pH7.00～7.30，酒精濃度8％，離子強度0.14，溫度-3±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置2小時；在攪拌下調節pH6.60～7.00，酒精濃度20％，離子強度0.14，溫度-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置2小時；在攪拌下加入助濾劑，攪拌反應30分鐘，壓濾，得沉澱組分（F123）和上清液（a）；

（B）對上清液（a）攪拌並調節：pH5.10～5.30，酒精濃度18％，離子強度0.14，溫度-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時；調攪拌下調節：pH6.00～6.20，酒精濃度40％，離子強度0.14，溫度-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置8小時；在攪拌下加入助濾劑，攪拌30分鐘，壓濾，收集上清液（b）和沉澱（F4-1）和（F4-4）；

（C）上清液（b）進行攪拌並調節：pH4.55～4.85，酒精濃度20％，離子強度0.14，溫度-11±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置5小時，攪拌30分鐘，壓濾，收集沉澱物白蛋白（FV）；

（D）取沉澱組分（F123）溶解並調節離子強度至0.015，pH5.00～5.20，酒精濃度17％，溫度-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘，壓濾，收集上清液（c）和沉澱（F1）；

（E）對上清液（c）進行攪拌並調節：pH7.30～7.50，酒精濃度25％，溫度-10±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時，壓濾，收集沉澱物（F2）。

3、根據權利要求1或2所述的壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法，其特徵在於：上述步驟A、B、C、D中採用醋酸鈉-醋酸緩衝液調節pH值。

4、根據權利要求1或2所述的壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法，其特徵在於：上述步驟E中採用碳酸氫鈉緩衝液調節pH值。

5、根據權利要求2所述的壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法，其特徵在於：步驟A中加入的助濾劑為硅藻土和珍珠岩，加入比例均為14克每毫升血漿。

6、根據權利要求2所述的壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法，其特徵在於：步驟B中加入的助濾劑為硅藻土，加入比例為21克每毫升血漿。

7、根據權利要求2所述的壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法，其特徵在於：步驟A、B、D所述的壓濾採用的壓力是在0～0.2兆帕的壓力下進行。

實施方式

《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》的方法，依次包括以下步驟：

1.白蛋白的製備

合併經檢測合格的血漿1000L，調節血漿溫度至2～4℃。

（A）在攪拌下調節以下血漿參數：用醋酸鈉-醋酸緩衝液調節pH7.00～7.30，加入95％的冷乙醇至乙醇濃度8％，離子強度0.14，溫度控制在-3±0.5℃，攪拌反應30分鐘。在醋酸鈉-醋酸緩衝液調節pH6.60～7.00，加入95％冷乙醇至乙醇濃度20％，溫度控制在-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘。在攪拌下加入硅藻土和珍珠岩各14千克，攪拌30分鐘，然後以0～0.2兆帕的壓力壓濾，濾板使用6095和6092各62張，壓濾後用380升洗液淋洗沉澱，然後吹乾，收集沉澱組分F123和上清液a。

（B）對上清液a在攪拌下調節如下：用醋酸鈉-醋酸緩衝液調節pH5.10～5.30，加入注射用水至乙醇濃度18％，離子強度0.14，溫度-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時。在攪拌下調節如下：用醋酸鈉-醋酸緩衝液調節pH6.00～6.20，加入95％乙醇至乙醇濃度40％，離子強度0.14，溫度控制-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置8小時。在攪拌下加入硅藻土21千克，攪拌30分鐘，然後用0～0.2兆帕的壓力壓濾，濾板使用6095和M70各36張，壓濾後用360升洗液淋洗沉澱，然後吹乾，收集上清液b和沉澱F4-1和F4-4。

（C）對上清液b在攪拌下調節如下：用醋酸鈉-醋酸緩衝液調節pH4.55～4.85，加入95％冷乙醇至乙醇濃度20％，離子強度0.14，溫度-11±-0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置5小時。攪拌30分鐘，然後以0～0.2兆帕的壓力壓濾，濾板使用6095和6492各40張，壓濾後吹乾，收集沉澱即為白蛋白FV。

2.球蛋白的製備：

（D）取步驟A得到的沉澱組分F123合計160千克，用690升注射用水溶解，用醋酸鈉調節到離子強度0.015。溶解液在攪拌下調節如下：用醋酸鈉-醋酸緩衝液調節pH5.00～5.20，加入95％乙醇至乙醇濃度17％，溫度控制-5±0.5℃，攪拌反應30分鐘。以0～0.2兆帕的壓力壓濾，濾板使用6095和6492各50張，壓濾後用380升洗液淋洗沉澱，然後吹乾，收集上清液c和沉澱F1。

（E）對上清液c在攪拌下調節如下：用碳酸氫鈉緩衝液調節pH7.30～7.50，加入氯化鈉調節離子強度0.05，加入95％乙醇至乙醇濃度25％，溫度-10±0.5℃，攪拌反應30分鐘，靜置6小時。以0～0.2兆帕的壓力壓濾，濾板使用6095和6492各24張，壓濾後吹乾，收集沉澱物即為球蛋白F2。

該發明壓濾使用的濾紙孔徑分別為18微米、2～3微米及0.45微米，壓濾使用的助濾劑為硅藻土和珍珠岩，硅藻土滲透率為0.30parcies，主要成份為二氧化矽，含量達到96％以上而重金屬含量極低，從而使過濾後的蛋白製品質量更高。

榮譽表彰

2015年11月27日，《壓濾工藝分離人血漿蛋白的方法》獲得第十七屆中國專利獎優秀獎。