基質細胞p85突變在乳腺腫瘤血管生成中的作用研究

《基質細胞p85突變在乳腺腫瘤血管生成中的作用研究》是依託武漢大學，由劉鑫擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：基質細胞p85突變在乳腺腫瘤血管生成中的作用研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：劉鑫
• 依託單位：武漢大學

項目摘要

乳腺癌是嚴重威脅女性健康和生命安全的惡性腫瘤，但其分子病理機制至今仍不十分清楚。癌組織中不同細胞間的信號通訊對腫瘤的發生髮展近期受到人們高度關注。PI3K是細胞內眾多信號轉導網路中心的重要激酶，研究發現約30%的乳腺癌病人PI3K 基因發生突變，這種突變對乳腺癌的發生髮展有何意義很不明確。本項目將圍繞腫瘤組織細胞之間相互關係，研究基質成纖維細胞PI3K激酶的p85α亞基突變在乳腺腫瘤血管生成中的作用。前期初步研究結果發現，p85α突變的成纖維細胞條件培養基（CM）可顯著促進血管內皮細胞HUVEC增殖及血管環的形成，後續研究將在現有基礎上，通過體外和體內實驗，確定基質成纖維細胞p85α突變促進血管內皮細胞增殖和轉移的信號分子，並闡明其作用機理和信號轉導途徑。研究結果將為理解基質細胞基因突變對乳腺癌發生髮展的意義、發展針對特定靶點的治療方法和早期基因診斷手段提供可行的實驗方法和理論依據。

結題摘要

國家自然科學基金青年科學基金項目(項目編號：81472550)， 項目名稱“基質細胞p85突變在乳腺腫瘤血管生成中的作用研究”，總資助金額 72萬元，起止日期 從 2015 年 1 月到 2018 年 12 月。目前關於項目的主要研究成果有四方面。 第一個方面，研究TEAD4及其缺失突變體在HeLa細胞中的定位。為了探究TEAD4的入核機制，我們首先從其胺基酸序列著手，通過PSORTⅡ軟體預測了TEAD4可能的兩段核定位序列，分別為59PPCGRRKI66、105LARRK109，並構建了這兩段序列的缺失突變體，我們發現缺失59-66位胺基酸序列導致TEAD4在細胞核內異常聚集；缺失105-109位胺基酸序列則導致TEAD4在胞漿中出現。 第二個方面，通過定點突變研究維持TEAD4蛋白穩態的關鍵位點。我們進行定點突變實驗，分別將三個半胱氨酸殘基突變為絲氨酸，結果發現C61S、C335S、C367S的TEAD4蛋白表達水平均低於野生型，尤以C335S、C367S最為明顯，應是發生了降解。因此，推測TEAD4 C335、C367是維持其蛋白穩定的關鍵位點。 第三個方面，通過RNA干擾、定點突變研究TEAD4對細胞增殖、轉移、周期的影響。為了研究這兩種缺失突變體對細胞生命活動的影響，我們通過慢病毒載體將全長TEAD4以及兩種缺失突變體導入HeLa細胞中，結果表明，相較於導入全長TEAD4的HeLa細胞和野生型HeLa細胞，導入了缺失突變體的HeLa細胞的細胞活力、遷移能力明顯下降，細胞粘附性增強，細胞周期相關蛋白表達水平下降。 第四個方面，通過RNA干擾研究TEAD4基因沉默對乳腺癌細胞凋亡及周期蛋白表達的影響。使用構建好的慢病毒表達載體（pLKO.1-TEAD4-siRNA）在相同條件下分別感染MDA-MB-231、MCF-7兩種細胞，Western-blot檢測CDK4、CDK2、cyclinE等周期蛋白的表達量。藉助流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。 在這些工作的基礎上，已經發表的由本基金支持的 SCI 文章 6 篇，在投文章 2 篇，將在兩年內發表。該基金培養了 9 名研究生，4 名已經畢業，5 名在讀。經費嚴格按照計畫規定使用，剩餘經費計畫用於本項目研究後續支出。