《基於FACS-酶微反應器的超高通量酶篩選系統》是依託上海交通大學，由楊廣宇擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：基於FACS-酶微反應器的超高通量酶篩選系統
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：楊廣宇
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
酶定向進化技術通過在實驗室中模擬自然進化過程，從海量突變庫中篩選功能發生重要改進的突變體，對於闡明蛋白質分子進化歷程、構建新功能酶等具有重要意義，但限制其廣泛套用的技術瓶頸之一是仍缺少有效的普適性超高通量篩選方法。在前期研究工作中，我們已成功地建立了對特定酶系統的螢光激活細胞分選（FACS）超高通量篩選技術。為提高該系統通用性，以利於多種酶系突變庫的篩選，本項目以脂肪酶隨機突變庫為模式系統，擬用微流控晶片製備體積高度均一的體外區室化（in vitro compartmentalization，IVC）酶微反應器，形成宿主細胞-酶活性-產物螢光信號的偶聯，進而套用FACS系統篩選獲得高穩定性和高催化活性的突變體。本項目所建立的通用型超高通量酶活性篩選技術，將完善酶定向進化技術體系，推動酶學理論和相關生物催化高技術的發展。
結題摘要
酶定向進化技術通過在實驗室中模擬自然進化過程，從海量突變庫中篩選功能發生重要改進的突變體，對於闡明蛋白質分子進化歷程、構建新功能酶等關鍵科學問題的解決均具有重要意義，但限制其廣泛套用的技術瓶頸之一是仍缺少有效的普適性高通量篩選方法。在本研究中，我們建立了基於體外區室化-螢光激活細胞分選（IVC-FACS）的通用型酶活性超高通量篩選方法，通過創造皮升級體積的“酶微反應器”，並利用流式細胞儀高速、可定量分析的特點對酶活性進行高速檢測和分選。本研究注重多學科交叉，通過藥劑學、微流控晶片、合成化學等多學科交叉技術的套用，最佳化了“水-油-水”二級微液滴的均一性和螢光信號的穩定性，從而極大地改善了IVC-FACS體系的靈敏度和準確度。套用該篩選體系，我們成功地對酯酶進行了定向進化，篩選獲得了催化活性顯著改善的突變體，顯示了該技術在酶活性篩選中的廣闊套用潛力。 本研究主要獲得的創新性成果有：（1） 開發了利用膜擠出法製備“水-油-水”二級微液滴的技術，相比於常規的勻漿儀乳化法獲得的微液滴均一度明顯提高。基於該液滴製備的酶微反應器具有良好的靈敏度和寬泛的動力學範圍，能準確分辨兩倍以下的酶活性差別，且酶動力學表現與大體積反應基本一致。將該體系進一步套用於酯酶AFEST的定向進化，經過一輪篩選即從200萬株突變體中獲得了催化效率提高2倍以上的突變體，其催化效率已接近分子擴散的速度極限。 （2）開發了基於微流控晶片技術，製備高度均一的“水-油-水”二級微液滴的方法，大大簡化了兩步法生成微流控二級微液滴的操作，生成的微液滴單分散性極高，使得液滴螢光反應的數據準確性可與傳統的孔板法相媲美。 （3）開發了基於微流控晶片的線上雙色監測分選體系，採用“水-油”一級微液滴作為酶微反應器，在微流控晶片上集成液流、檢測、分選裝置，可以同時檢測兩種螢光信號，適合於對酶進行立體選擇性、區位選擇性等雙底物篩選。 （4）建立了螢光底物設計的“螢光液滴捕獲(FDE)”原理。通過控制分子親水性和疏水性的平衡，以磷酸三脂酶為模型設計合成了適用於微反應器篩選的新型螢光底物，可有效提高分選準確度及降低螢光背景干擾，一輪篩選的富集效率即可達900倍以上。
