《基於蛋白表面相互作用的AChE酶定向固定化研究》是依託中國農業大學，由孫英擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於蛋白表面相互作用的AChE酶定向固定化研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：孫英
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
針對當前食品安全和殘留監控現狀，本項目提出擬以AChE酶蛋白表面分子模擬為先導，通過以酶蛋白非活性位點為受體腔進行酶的定向固定配基的虛擬篩選，將目標蛋白酶定向固定到載體表面。通過對影響酶固定多項因素的考察，最佳化定向固定配基的組裝和修飾方法；闡明固定化AChE酶機制，明確影響定向固定AChE酶穩定性的要素；建立基於蛋白表面相互作用的酶的定向固定新技術，為構建更加靈敏，穩定，高效的農藥殘留快速檢測酶生物感測體系提供有力而可靠的實驗及理論基礎。
結題摘要
針對當前食品安全和農藥殘留監控現狀，本項目以AChE 酶蛋白表面分子模擬為先導，通過以酶蛋白非活性位點為受體腔進行酶的定向固定配基的虛擬篩選，構建小分子配基庫，進而獲得一種新型酶定向固定化技術，並基於此採用電化學方法開發出新型酶生物感測器，用於有機磷農藥檢測。研究結果表明： 通過綜合分析AChE酶蛋白表面性質信息及結構特點（腔深、疏水性、電性等），Sybyl軟體與CASTp蛋白表面三維結構計算平台所獲得的分析信息，最終選定Site1號位點為對接腔，作為定向固定化AChE酶小分子配基篩選的位點。 通過對近五萬餘個小分子化合物的篩選，最終選取2類（阿托品、類兒茶素黃酮類化合物），共5個化合物作為正式的AChE定向固定化的小分子配基。 螢光光譜實驗證明5個小分子配基均與AChE酶表面具有相互作用，但相互作用強度具有不同。其結合強度由強到弱依次為二氫檞皮素＞檞皮素＞(-)-表兒茶素＞(+)-兒茶素＞阿托品。 分子對接結果可以看出， 4個類兒茶素黃酮類化合物（(+)-兒茶素、(-)-表兒茶素、檞皮素、二氫檞皮素）小分子配基與AChE酶結合的構象較為相似，骨架基本重合，說明分子結構對結合構象直接具有決定作用，而結合強度的差異來源於小分子上活性官能團的位置和種類。阿托品的結合強度較弱是由於其分子中含有羥基等活性官能團的數量比類兒茶素黃酮化合物明顯較少。 通過兒茶素定向固定的AChE酶生物感測器的底物ATCL的催化能力很強，將製作的AChE/CA/CC/CS/GCE進行電化學測量，所製得的感測器對底物ATCL具有很好的靈敏度，分別為：9.8μA mM-1，6.0μA mM-1。製備的AChE/CA/CC/CS/GCE電極具有更寬的pH適用範圍和較低的檢測電位，同時製作的生物感測器重複性相對標準偏差為2.6%，半個月後仍保持起始回響的81%，一個月後仍然維持在初始回響的80%，說明製備的感測器有很好的穩定性。 在最優條件下，以氯化乙醯硫代膽鹼為底物，基於農藥對酶的抑制原理，對毒死蜱進行了檢測。農藥的濃度與抑制率在0.5-60μg/L和60-150μg/L這兩個範圍內分別存線上性關係。線性方程分別為y=0.829x-0.386，R2=0.999; y=0.365x+28.82，R2=0.992。檢出限為0.43μg/L。
