《基於腫瘤細胞代謝的NQO1底物抗腫瘤作用的分子機制研究》是依託上海交通大學，由程學芳擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：基於腫瘤細胞代謝的NQO1底物抗腫瘤作用的分子機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：程學芳
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
NAD(P)H:醌氧化還原酶1（NQO1）作為一個潛在的抗腫瘤藥物靶點，其底物被廣泛證明具有確切的抗腫瘤活性，表現為NQO1依賴的DNA損傷、誘導細胞凋亡等特徵，但目前關於NQO1底物抗腫瘤活性的分子機制仍不清楚。本項目前期研究發現NQO1底物β-拉帕醌短時間刺激即可顯著影響A549細胞的代謝，其中糖酵解末端產物丙酮酸和乳酸的含量明顯降低；此外，在培養基中添加丙酮酸可顯著逆轉β-拉帕醌的細胞毒作用。且這種迅速發生的代謝擾動優先於凋亡發生過程的啟動。基於此提出假說：NQO1底物通過改變腫瘤細胞的代謝模式，影響代謝中間產物的含量，進而啟動細胞凋亡程式，發揮抗腫瘤作用。因此，本項目擬結合代謝組學和分子生物學技術，從化療藥物對生化代謝影響這個角度深入探索其抗腫瘤作用的內在機制，為靶向NQO1的醌類抗腫瘤藥物研發提供科學理論依據，為尋找新的抗腫瘤靶點提供線索和依據。
結題摘要
本部分內容擬從代謝調節這個全新的角度來闡明NQO1介導的β-拉帕醌生物活化及分子調控機制。基於LCMS-Q-TOF和GC-MS技術的細胞代謝組學研究方法發現：β-拉帕醌刺激可顯著地改變A549細胞的代謝模式，β-拉帕醌影響了A549細胞的多條代謝通路，主要包括抑制糖酵解途徑和三羧酸循環，並增強磷酸戊糖途徑。同位素示蹤實驗（1,6-13C2-葡萄糖作為示蹤劑）進一步證實了上述代謝通路分析結果，並初步提示PKM2催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的代謝環節是β-拉帕醌的關鍵調控節點。通過qRT-PCR檢測糖代謝通路中關鍵酶或轉運體的表達發現，β-拉帕醌對PKM2基因表達無明顯影響。酶活性分析發現β-拉帕醌可時間依賴性地抑制細胞內PKM2丙酮酸激酶活性。此外，NQO1特異性抑制劑雙香豆素/N-乙醯半胱氨酸能顯著逆轉β-拉帕醌誘導的PKM2活性下降，提示β-拉帕醌能引起NQO1依賴ROS介導的PKM2活性下降。為了揭示β-拉帕醌的抗腫瘤效應與PKM2活性抑制之間的關係，進一步通過變構激活、變構抑制和PKM2基因瞬時沉默手段干預A549細胞內PKM2的活性，考察其對β-拉帕醌細胞毒作用的影響。研究結果顯示：PKM2變構激活劑TEPP-46可顯著逆轉β-拉帕醌的凋亡誘導作用；PKM2抑制劑和基因沉默則進一步增加β-拉帕醌的細胞毒作用；培養基中補充PKM2下游產物丙酮酸可顯著逆轉β-拉帕醌的凋亡誘導作用。以上結果提示PKM2活性抑制是β-拉帕醌誘導腫瘤細胞凋亡的關鍵分子機制。進一步研究發現，短時間內，丙酮酸不能抑制β-拉帕醌“還原-自氧化-還原”循環過程中ROS的產生或作為抗氧化劑清除ROS，同時對細胞內NAD+水平無明顯影響但可逆轉β-拉帕醌所引起的NAD+耗竭。谷氨醯胺和檸檬酸的補給實驗也排除了丙酮酸通過線粒體途徑拮抗β-拉帕醌的凋亡誘導作用。前期研究結果表明，NQO1依賴的SIRT1-FOXO1凋亡信號通路是β-拉帕醌發揮抗腫瘤活性的關鍵分子機制之一，我們的研究發現丙酮酸能抑制 SIRT1-FOXO1 凋亡信號通路。綜上所述，本部分內容揭示了 β-拉帕醌通過抑制 PKM2 活性，使細胞內 6-磷酸葡萄糖蓄積，增強磷酸戊糖通路，降低丙酮酸水平，誘導SIRT1-FOXO1 凋亡信號通路，進而促進細胞凋亡。
