《基於滾環擴增的海洋產毒藻類膜分類晶片檢測技術》是依託哈爾濱工業大學，由陳國福擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：基於滾環擴增的海洋產毒藻類膜分類晶片檢測技術
- 依託單位：哈爾濱工業大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：陳國福
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
我國有害藻類危害嚴重，特別是產毒藻類嚴重威脅水產品安全和公共衛生健康。因此，亟待建立有效的高通量檢測技術對各種產毒藻類進行實時監控。由於傳統形態鑑定法的局限性，套用分子生物技術對有害藻類進行檢測成為當前的研究熱點。然而，以往建立的技術只能實現單種有害藻類的檢測，且現行的基因晶片檢測技術實用性存在不足。本項目擬建立一種可用於我國沿海產毒藻類高通量檢測的新方法-基於滾環擴增的膜分類晶片檢測技術。項目聚焦於我國沿海的產毒微藻，通過生物信息學檢索或基因克隆測序，獲取目標藻種的核糖體基因序列，設計分類探針、鎖式探針及通用擴增引物，並研製膜分類晶片，通過滾環擴增標記靶核酸，將靶核酸與膜分類晶片雜交，根據顯色斑點直觀判斷待檢樣品中目標藻的有無。本研究建立的檢測技術具有高特異性和高靈敏度，克服現有晶片檢測技術的缺點，增強了基因晶片用於有害藻類高通量檢測的實用性，因此對有害藻類研究及預警具有重要現實意義。
結題摘要
我國有害藻類危害嚴重，特別是產毒藻類嚴重威脅水產品安全和公共衛生健康。因此，亟待建立有效的高通量檢測技術對各種產毒藻類進行實時監控。由於傳統形態鑑定法的局限性，套用分子生物技術對有害藻類進行檢測成為當前的研究熱點。然而，以往建立的技術只能實現單種有害藻類的檢測，且現行的基因晶片檢測技術實用性存在不足。本項目建立了一種可用於我國沿海產毒藻類高通量檢測的新方法—滾環擴增（RCA）－膜分類晶片檢測技術。項目的主要研究容包括：（1）選取常見海洋常見產毒微藻作為研究對象，通過分子克隆測序獲得其靶基因（核糖體大亞基rDNA）序列；（2）通過同源比對分析，設計了各目標藻的特異性鎖式探針（PLP）、陽性和陰性探針、通用引物P1和P2及分類探針cZip，並對PLP和分類探針的特異性進行了驗證；（3）採用尼龍膜為探針載體，通過加尾反應對分類探針進行加尾，採用紫外交聯的方法固定探針，製備可用於多重雜交檢測的膜分類基因晶片；（4）對RCA-膜分類晶片檢測技術的各條件進行了最佳化，對RCA-膜分類晶片的檢測靈敏度進行了評估並與PCR-膜分類晶片檢測靈敏度進行比較；（5）套用RCA-膜分類晶片對模擬自然水樣和環境水樣進行了分析。主要結果包括：（1）成功建立了多重RCA體系，證明所設計的PLP和分類探針具有特異性；（2）成功製備出可並行分析多重RCA產物的膜基DNA陣列；（3）確定了最優檢測參數：PLP連線溫度61 °C，PLP連線時間70 min，RCA擴增溫度64 °C，RCA擴增時間50 min，紫外交聯時間1 min，探針上樣量10 ng，RCA產物濃度250 ng，雜交時間2 h，雜交溫度44 °C和洗膜溫度50 °C；（4）確定了RCA-膜分類晶片檢測技術的質粒檢測限為10 copies/μL，細胞檢測限為0.1 cell，比PCR-膜晶片在檢測藻細胞數方面靈敏度高1個數量級；（5）證實了RCA-膜分類晶片具有較強實用性：對自然樣品的分析結果顯示，其檢測結果與光鏡鏡檢測結果無顯著差異（P＞0.05），滿足自然樣品分析要求。本研究建立的檢測技術具有高特異性和高靈敏度，可克服現有晶片檢測技術的缺點，增強了基因晶片用於有害藻類高通量檢測的實用性，因此對有害藻類研究及預警具有重要現實意義。
