基於新一代測序技術的DMD無創產前診斷研究

《基於新一代測序技術的DMD無創產前診斷研究》是依託中南大學，由鄔玲仟擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：基於新一代測序技術的DMD無創產前診斷研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：鄔玲仟
• 依託單位：中南大學

項目摘要

杜氏肌營養不良（DMD）是最常見的致死性肌肉疾病，致病基因DMD位於Xp21.2，全長2.4Mb，突變類型多，外顯子缺失/重複突變約占70%,散發病人新發突變占1/3。該病無有效治療方法，建立無創產前診斷已成為亟待解決的熱點問題。本原理論證研究針對遺傳和新發DMD基因外顯子缺失和重複突變胎兒，用孕婦外周血漿游離DNA為研究材料，通過目標區域捕獲和新一代測序技術，進行外顯子捕獲和高通量測序，比較胎兒外顯子缺失/重複組與對照組間目標外顯子數據的差異，完成胎兒和孕婦DMD的遺傳狀態分析，研究不同數據分析方法，建立遺傳性和新發性胎兒DMD基因缺失/重複型突變無創產前診斷新方法。實現存在/不存在孕婦DMD基因外顯子雜合性缺失/重複突變背景下，檢測胎兒DMD基因外顯子178bp缺失/重複，該方法可套用於其他攜帶小片段外顯子缺失/重複突變基因的無創產前診斷，不同以往技術僅限於檢測胎兒性別或染色體異倍體。

結題摘要

背景 杜氏肌營養不良（DMD）是最常見的致死性肌肉疾病，致病基因 DMD 位於 Xp21.2，全長2.4Mb，突變類型多，外顯子缺失/重複突變約占 70%，散發病人新發突變占 1/3。該病無有效治療方法，建立無創產前診斷已成為亟待解決的熱點問題。而目前無創產前檢測均基於雜交捕獲方法，由於該技術原理上的缺陷，靈敏度相對較低，難以檢測在母源變異背景下，因胎源發生變異引起的微量差異。 研究內容 ①試圖建立基於反向PCR和barcode的環化單分子擴增和重測序技術（cSMART）,可將目標區域cfDNA分子悉數捕獲、富集,再通過高通量測序,避免複製錯誤和偏倚、實現對突變區域單分子的定性和絕對定量。②引入mate pair建庫方法和高通量測序平台，開展基因組區域斷裂點精確定位方法學的研究，並完成數例DMD家系的斷裂點精確定位和驗證。③針對大片段區域缺失重複引起的DMD，創新性地提出了先行缺失區域斷裂點精確定位，結合斷點cSMART檢測，通過斷裂前後模板數比例的比較，推測出胎兒基因型的方案，並嘗試套用於缺失型DMD無創產前檢測研究中。 重要結果和關鍵數據 ①發明了高精度、高捕獲率、無偏倚進行血漿游離DNA擴增的cSMART方法，達到僅需抽取孕婦外周血就能檢測出胎兒特定位點是否發生突變的目標，完成了多個常見單基因病臨床樣本的試驗，與常規產前檢測結果具有較高的一致率。②針對缺失型DMD無創產前檢測，提出先進行斷裂點精確定位，再使用cSMART方法檢測斷裂缺失前後模板數差異的策略。③建立了基於mate pair方法的基因組結構變異精確定位方法，並套用於DMD缺失樣本斷裂點定位研究中。 科學意義 發明了基於循環單分子擴增和重測序技術（cSMART），被國際同行譽為“分子診斷的革命性突破”，並引起了產業界的高度關注。完成在DMD、PKU、SMA和地中海貧血等遺傳病無創產前檢測，結果表明可用於其它遺傳單基因病的無創產前診斷，複合準確度高於99%，靈敏度高達1/10000。且在腫瘤早期診斷具有更廣泛的套用前景，可以準確定量血液中低水平的腫瘤特異性循環DNA和用於監測病人對治療的反應。建立Mate pair高通量測序進行全基因組結構變異定位方法，可用於結構變異導致染色體斷裂重組引起的遺傳病致病位點的尋找及機制的研究，有助於發現或克隆新的致病基因。