高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代測序技術(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細緻全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。
基本介紹
- 中文名：基因組高通量測序
- 外文名：high-throughput_genome_sequence_database
- 屬於：對傳統測序一次革命性的改變
- 被稱為：深度測序
技術發展,原理,
技術發展
高通量測序平台(high-throughput_genome_sequence_database) 自從2005年454 Life Sciences公司（2007年該公司被Roche正式收購）推出了454 FLX焦磷酸測序平台（454 FLX pyrosequencing platform）以來，曾推出過3730xlDNA測序儀（3730xl DNA Analyzer）的Applied BioSystem（ABI）這家一直占據著測序市場最大份額的公司的領先地位就開始動搖了，因為他們的拳頭產品毛細管陣列電泳測序儀系列（series capillary array electrophoresis sequencing machines）遇到了兩個強有力的競爭對手，一個就是羅氏公司(Roche)的454 測序儀(Roch GS FLX sequencer)，，另一個就是2006年美國Illumina公司推出的Solexa基因組分析平台（Genome Analyzer platform），為此，2007年ABI公司推出了自主研發的SOLiD 測序儀(ABI SOLiD sequencer)。這三個測序平台即為目前高通量測序平台的代表。
在最近幾年中，高通量測序技術已經由以凝膠板為基礎的方法(例如“S放射標記測序手冊、ABl 373、ABIPRISM 377、Li-corIR2型DNA測序儀)發展到毛細管測序儀(如ABI Prism 3100、3700和3730xl型DNA測序儀，Megabace1000和Megabace 5000)測序，已有關於製備DNA和測序的方法及設備的評論發表(Meldrum，2000a，b)。利用毛細管測序儀的轉變解決了凝膠板技術內在的通路追蹤問題，毛細管測序儀的自動化顯著提高了處理量，同時提供了更長的可測序長度。這些進展顯著增加了近些年產生的人類病原體的基因組數據。
TIGR現在的尖端測序設備包括25台ABIPrism 3700DNA分析儀、24台AppliedBiosystems 3730xlDNA分析儀、6台ABIPrism 3100DNA分析儀。約有50個項目在同時進行。在2001年進行的測序反應超過了3 400 000個，而到2002年底已完成了6 000 000個反應。TIGR現今的測序能力為每年14 000 000個測序流程。
原理
測序方案建立在雙脫氧測序法(Sanger等，1977)的基礎上。為了從每一克隆插入片段兩端成對地進行測序，每一個質粒模板DNA板應配備兩個384孔循環測序反應板。測序反應採用Big Dye Terminator chemistry version 3．1(AppliedBiosystems)和標準M13或常用正向引物和反向引物。測序反應通過BiomekFX(Beckman)移液操作工作站建立。機械臂負責等分模板試樣，起與反應液混合的作用，反應液含有雙脫氧核苷酸、螢光標記的核苷酸、TaqDNA聚合酶、序列引物和緩衝液。模板和反應板有條形碼，且在BiomekFX移液操作工作站上有條形碼讀取器跟蹤，確保模板和反應液轉移中沒有錯誤。30～40線性擴增步驟連續循環在MJResearchTetrads或9700熱循環儀(Ap—pliedBiosystems)中進行。反應產物可以用異丙醇在室溫下高效率沉澱，4C下保存或懸浮在水中密閉保存。如果測序儀器正常，在掃描反應板的條形碼後，會自動為每一反應板生成一個樣品膜。然後將反應板移至一台ABIPrism3700DNA分析儀或AppliedBiosystems 3730xiDNA分析儀上，進行電泳。現在的多聚體和軟體允許每天在ABIPrism 3700 DNA分析儀上進行8次電泳，在AppliedBiosystems 3730xlDNA分析儀上進行12次，調試時間少於1h。
平行運行大量工作的高通量測序設備通常需要通過實驗室信息管理和樣品跟蹤系統(1aboratory information management and sample tracking system，LIMS)(Kerlavage等，1993)進行自動化管理。在TIGR，這種系統包括從文庫構建早期經測序到結束的樣品跟蹤的整套軟體。經過這種處理，數據保存在Sybase關係資料庫表格中。資料庫儲存和聯繫在整個基因組測序流程中所收集的全部數據，允許使用者以各種方式回溯數據流，可從已經注釋的基因回溯到基因的原始測序跟蹤檔案。這個系統包括樣品管理、數據輸入、文庫管理和序列加工的客戶端/伺服器套用軟體。經過多年改進，並且結合新的實驗室方法、新型的儀器和軟體，這一系統已成熟穩定。這些整合套用包括自動載體清除、確定和禁止重複元件、發現污染的克隆和跟蹤克隆及模板信息。
在測序流程中，生成的模板和序列的質量每天可通過用戶友好界面系統地監控。這就保證了迅速發現並改正工作中的潛在問題。通常，質量控制和質量測評(qualitycontrol/qualityassessment，QC/QA)組共同套用質量檢測標準。他們負責檢驗和提供試劑給生產組，並在流程中檢測模板質量、調查失敗和偏離正常表現範圍的情況、監控數據質量、審計、確定可改進的方面、製作控制檔案(標準操作步驟)，以保證這些檔案具有格式上的一致性和技術上的準確性。
