《固氮基因表達調控的生化基礎研究》是王憶平為項目負責人，北京大學為依託單位的重點項目。
基本介紹
- 中文名：固氮基因表達調控的生化基礎研究
- 項目類別：重點項目
- 項目負責人：王憶平
- 依託單位：北京大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
s54-RNA聚合酶調控的基因多數有著獨特的生理功能，與生物固氮、環境、人類健康等息息相關。本研究著重於與固氮基因表達調控密切相關的s54-RNA聚合酶激活複合體的組裝機制及其結構與功能研究。最新研究表明，s54-RNA聚合酶的轉錄需要具ATP水解活性的AAA+家族蛋白的特異性激活，同時激活蛋白與s54-RNA聚合酶的相互作用可以由DNA環化結構來促進，而此DNA環化結構一般由蛋白介導的DNA彎曲來穩定。本研究擬從s54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA彎曲蛋白及其靶位點這些主要元件出發，通過構建一系列突變體，測定它們的體內轉錄活性和體外各項生化、物理指標，揭示s54-RNA聚合酶激活複合體的組裝機制及其結構與功能。本項目除包括基礎分子生物學研究技術外，還將運用近年來迅速發展的冷凍電鏡三維重構，螢光共振能量轉移等新技術，為解析複雜蛋白DNA複合體提供了必要的研究手段。
結題摘要
本項目著重於與固氮基因表達調控密切相關的sigma54-RNA聚合酶激活複合體的組裝機制及其結構與功能研究。最新研究表明，sigma54-RNA聚合酶的轉錄需要具ATP水解活性的AAA+家族蛋白的特異性激活，同時激活蛋白與sigma54-RNA聚合酶的相互作用可以由DNA環化結構來促進，而此DNA環化結構一般由蛋白介導的DNA彎曲來穩定。本研究從sigma54-RNA聚合酶、AAA+家族激活蛋白、DNA彎曲蛋白及其靶位點這些主要元件出發，通過構建一系列突變體，測定它們的體內轉錄活性和體外各項生化、物理指標，揭示sigma54-RNA聚合酶激活複合體的組裝機制及其結構與功能。首先，我們發現DNA的物理特性參與基因表達調控。研究表明，IHF靶位點通過其自身的剛性阻礙DNA環化結構的形成，抑制增強子結合蛋白和sigma54-RNA聚合酶之間的相互作用，從而起到了類似真核中的insulator DNA的作用，對其深入研究必將擴展人們對於原核生物基因調控網路的認識。其次，我們構建了sigma54因子的突變體庫，並在五個方面，對所有的突變體在體外進行了功能測試。最後，對AAA+家族激活蛋白的研究結果發現，AAA激活蛋白通過“分子瑜伽規則”完成其組裝過程，對深入了解蛋白質非保守區，特別是不同功能區之間的鉸鏈區的功能，揭示蛋白質組裝機制對其功能的調節作用起到非常重要的理論指導作用； 此外，我們還對與固氮基因表達調控密切相關的，主管四碳二羧酸運輸系統（dct）的二元調控系統的信號傳導機理進行了比較深入的研究，取得了非常可喜的研究成果。發現通過配體結合，導致DctB膜外部分的二聚體界面上亮氨酸拉鏈打開，從而導致DctB膜內部分S-Helix鉸鏈形成一種“打開的剪刀式”二聚體構象，進而導致整個DctB組氨酸激酶形成一種總體打開的二聚體構象。這些研究成果進一步揭示了與固氮相關的信號轉導機制和基因表達調控機理，為提高生物固氮效率打下了堅實的理論基礎。
