囊泡分選蛋白VPS33B在血小板α顆粒形成中的機制研究

《囊泡分選蛋白VPS33B在血小板α顆粒形成中的機制研究》是依託上海交通大學，由王學鋒擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：囊泡分選蛋白VPS33B在血小板α顆粒形成中的機制研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：王學鋒
• 依託單位：上海交通大學

項目摘要

血小板顆粒內容物的釋放參與多種重要的生理病理過程，內容物能否正確運載取決於顆粒的正確形成，α顆粒作為主要運載體，目前對其形成過程及機制了解甚少。VPS33B異常可導致α顆粒缺失。我們用免疫沉澱結合蛋白質譜篩選出多種可能存在相互作用的蛋白，包括VIPAR、NBEAL2和Rab蛋白家族等，但它們的具體作用機制尚不明確。本研究擬分別從細胞和動物水平闡述VPS33B蛋白在α顆粒形成中的作用機制：通過免疫沉澱和蛋白印跡方法驗證與VPS33B相互作用蛋白並結合螢光共聚焦顯微鏡確定這些蛋白胞內定位；採用shRNA技術特異性敲除某種蛋白，觀察其他相關蛋白的胞內定位；構建巨核系/血小板VPS33B條件敲除小鼠，通過系列血小板功能試驗和誘導止血發生實驗在體評價血小板α-顆粒缺失對凝血過程的影響。結果有望揭示血小板α-顆粒形成的細胞生物學機制，為闡述血小板α-顆粒異常疾病發病機制提供理論基礎。

結題摘要

血小板顆粒內容物的釋放參與多種生理病理過程，內容物能否正確運載取決於顆粒的正確形成，α顆粒作為主要運載體，目前對其形成過程及機制了解甚少。ARC綜合症是一種常染色體隱性遺傳性疾病，表現為關節攣縮、腎功能衰竭以及血小板α-顆粒內容物的缺失，研究表明Vps33b基因突變是導致這個疾病發生的分子機制之一，因此我們推測Vps33b蛋白可能參與了α-顆粒的形成。在本研究中，我們選用HEK293T和Meg01細胞作為研究工具，利用蛋白質譜和免疫共沉澱的方法，確定了VIPAR、Sec22b和α-tubulin與 Vps33b蛋白存在相互作用，並通過構建表達Vps33b不同截短體蛋白結合免疫沉澱，發現Vps16b與全長的Vps33b蛋白結合，而α-tubulin和Sec22b則分別與Vps33b中的兩個Sec-1片段結合。Confocal結果顯示，在分化的Meg01細胞生成前血小板的向外延伸的神經突觸樣細絲中，Vps33b複合物呈現出細絲狀分布，vWF陽性囊泡與Vps33b複合物存在明顯的共定位現象，提示Vps33b參與了血小板α-顆粒的運輸。我們分別構建了全身性Vps33b基因敲除小鼠、巨核系/血小板特異性Vps33b基因敲除小鼠以及他莫昔芬誘導的造血幹細胞Vps33b基因敲除小鼠三種模型，結果發現Vps33b基因純合缺失的小鼠存在胚胎早期致死性；在對巨核系/血小板特異性Vps33b基因敲除小鼠的血小板進行檢測時，發現Vps33b蛋白僅有部分被敲除，血小板α-顆粒的形成以及血小板相關功能仍未受到影響；但當我們對造血幹細胞Vps33b基因敲除的小鼠血小板進行檢測時發現Vps33b蛋白被完全敲除，並表現為α-顆粒的缺失和相關聚集功能受損，並且發現Vps33b蛋白的產生階段早於巨核細胞的發生。為了進一步證實Vps33b複合物參與血小板α-顆粒的形成，我們通過分離胎肝誘導分化原代巨核細胞，分別觀察Vps33bfl/fl-Scl-Cre-和Vps33bfl/fl-Scl-Cre+小鼠巨核細胞不同分化階段的vWF陽性囊泡（作為α-顆粒的指示標記）和α-tubulin的定位情況，發現Vps33b蛋白敲除的巨核細胞在分化階段存在vWF陽性囊泡向遠端運輸障礙，vWF陽性囊泡均滯留在巨核細胞胞滯留在巨核細胞胞漿內，揭示Vps33b蛋白可能是通過與α-tubulin的結合參與α-顆粒在胞內的運輸。