《嗜熱內酯酶活性中心區域進化構建磷酸三酯酶》是依託上海交通大學，由馮雁擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：嗜熱內酯酶活性中心區域進化構建磷酸三酯酶
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：馮雁
- 依託單位：上海交通大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
有機磷化合物(包括有機磷殺蟲劑和化學戰神經毒劑)能不可逆抑制脊椎動物體內神經系統的乙醯膽鹼酯酶，其對人及家畜等產生的強毒副作用已引起高度關注。磷酸三酯酶能有效地水解有機磷化合物，在生物防恐及醫藥工業有重要套用潛力。但目前大多數微生物磷酸三酯酶穩定性差，限制了其廣泛套用。我們在前期研究中發現，來源於嗜熱細菌Geobacillus kaustophilus HTA426的內酯酶具有磷酸三酯酶活力，結構解析表明，其與磷酸三酯酶具有相似的基本骨架，而活性部位loop結構的差異可能為形成兩類酶功能差異的根源。為探討酶分子進化途徑並構建穩定的磷酸三酯酶，本項目以嗜熱內酯酶為模式酶，通過loop嫁接、關鍵位點突變等系列分子改造技術，構建對有機磷化合物具有高效、廣譜水解能力的進化酶。本項目將突破單點突變的進化局限性，發展區域進化的酶功能快速進化新途徑，豐富和發展酶趨異進化的理論和實踐。
結題摘要
有機磷化合物(包括有機磷殺蟲劑和化學戰神經毒劑)能不可逆抑制脊椎動物體內神經系統的乙醯膽鹼酯酶，其對人及家畜等產生的強毒副作用已引起高度關注。磷酸三酯酶能有效地水解有機磷化合物，在生物防恐及醫藥工業有重要套用潛力。但目前大多數微生物磷酸三酯酶穩定性差，限制了其廣泛套用。來源於嗜熱細菌Geobacillus kaustophilus HTA426的內酯酶具有磷酸三酯酶活力，結構解析表明，其與磷酸三酯酶具有相似的基本骨架，而活性部位loop結構的差異可能為形成兩類酶功能差異的根源。本項目以嗜熱內酯酶為模式酶，探討了酶分子進化途徑，並構建穩定的磷酸三酯酶。取得了以下創新性成果： 1. 內酯酶 (GkaP)活性熱點胺基酸 (Tyr99和Gly209)對酶底物選擇性及催化活性具有重要影響。突變體Y99L對磷酸三酯酶底物的催化效率提高10倍，而對內酯酶底物的催化效率降低了15倍，兩種酶催化效率比值相差大約154倍；該點突變可以導致底物譜的逆轉，為新功能酶構建提供新思路；突變體G209D能顯著提高兩種酶的催化活力，預期可能通過加強質子轉移效率，從而使酶活力提高。進一步晶體結構分析揭示了酶分子進化機制。我們的工作表明單個胺基酸取代就能影響了底物結合loop區的幾何構象，從而改變“非專一性”酶對不同結構底物的識別和催化能力，該工作為理解“非專一性”酶的催化機制提供了新的線索。 2. 結合理性設計和定向進化的的策略，成功地將GkaP由一個“非專一性”酶轉變成了專一化的有機磷水解酶。通過四輪定向進化，最優突變體（含七點突變）對於有機磷殺蟲劑對氧磷的催化效率比野生型提高了232倍，對於其它常用但難降解的有機磷殺蟲劑（對硫磷、地亞農和氯蟎硫磷）的水解速率提高了17-497倍，極大地拓寬了對有機磷殺蟲劑的選擇性。本研究為通過實驗室進化手段創造高效的催化劑提供新實例，為有機磷毒物的降解提供了潛在的解決方案。
