單克隆位點

載體上含有的一段人工合成的DNA片段，其上含有單一酶切位點，是外源DNA的插入部位，具備條件：是載體中的一段鹼基序列，由一個酶切位點組成，這個位點在載體上是單一位點。單克隆位點常適用於基因工程和分子克隆等過程中。

基本介紹

• 中文名：單克隆位點
• 外文名：Monoclonal site
• 領域：基因工程等
• 學科：套用生物學
• 位置：基因載體
• 本質：鹼基序列

克隆

克隆是英文"clone"或"cloning"的音譯，而英文"clone"則起源於希臘文"Klone"，原意是指以幼苗或嫩枝插條，以無性繁殖或營養繁殖的方式培育植物，如扦插和嫁接。在大陸譯為“無性繁殖”，在台灣與港澳一般意譯為複製，轉殖或群殖。 中文也有更加確切的詞表達克隆，“無性繁殖”、“無性系化”以及“純系化”。克隆是指生物體通過體細胞進行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的後代個體組成的種群。通常是利用生物技術由無性生殖產生與原個體有完全相同基因的個體或種群。

柯斯質粒載體單克隆位點

柯斯質粒載體(cosmid vector)又叫黏粒載體，這是一種由人工構建的含有DNA的COS序列和質粒複製子的特殊類型的質粒載體。柯斯質粒在結構組成上具有A噬菌體的特性，也具有質粒載體的特性和高容量的克隆能力，一般可插入35～40 kb的外源基因，這是構建真核生物基因文庫的主要載體。

柯斯質粒上帶有多個單克隆位點(RF2)、兩個COS位點、DNA複製起始位點和抗生素抗性基因，在兩個COS位點之間還有一個限制性內切酶位點(RE1)。克隆時，先用REl將柯斯質粒切開，再用單克隆位點中的某個限制性內切酶(RE2)酶解，然後將用經RE2酶解的大約40 kb大小的外源DNA片段克隆進單克隆位點，形成一個長大約50 kb的線性DNA分子，這個DNA分子由於含有兩個相距約50 kb的cos位點，因此可以在體外包裝進入空的噬菌體的頭部，沒有插入DNA的空載體或插入片段大小不符合要求的重組分子則無法包裝。重組噬菌體的DNA可以通過浸染大腸桿菌而傳遞。一旦進入大腸桿菌，由於進入頭部時兩個cos位點都已切割掉了，它們通過鹼基配對可以將整個DNA分子變成一個環狀的質粒分子，複製起始位點的存在又可以保證其在宿主細胞中穩定複製保持，轉化的細胞可以通過抗生素進行篩選。柯斯質粒適用於作基因簇和大基因的克隆，如圖1。

圖1 柯斯質粒載體單克隆位點

質粒載體的多克隆位點

幾乎所有的基因工程載體都含有一個人工合成的密集排列的系列多克隆位點，稱為載體多克隆位點，或稱多接頭或稱限制性酶切位點庫，由常用的限制性內切酶所能識別的序列組成。這些酶切位點一般都是單一的，在質粒其他部位不再有這些位點。這樣就提供了質粒單獨或聯合使用時的便利，並可選用任一種或幾種酶作酶切後能產生合適的DNA片段。這種片段有合適的末端接頭，也簡化了對外源DNA片段進行限制性酶酶切作圖工作。將所有可能的克隆位點匯集於質粒的同一位置，不利之處是不能利用選擇標誌的失活來篩選重組體。但這一缺點可用別的方法來彌補。例如將一連串克隆位點引入到某種酶(如β一半乳糖苷酶)的一個具有特殊活性片段的編碼基因中，外源DNA插入使之出現非活性片段。由於重組克隆失去了水解生色底物酶的能力，可根據顏色使重組體與非重組體分開。