《咖啡酸對LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞損傷的保護機制》是依託揚州大學，由劉明江擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：咖啡酸對LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞損傷的保護機制
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：劉明江
- 依託單位：揚州大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
奶牛乳腺上皮細胞（BMEC）在奶牛乳房炎發生過程中易受損害。“金蒲灌注劑”是申請者參與研發的治療急性奶牛乳房炎的純中藥製劑。前期研究證實LPS誘導BMEC線粒體膜電位明顯降低、胞內ROS蓄積和促炎性因子大量釋放，破壞細胞形態結構；咖啡酸（該製劑主要活性成分）可有效減輕LPS誘導的細胞結構損傷和凋亡，但其作用機制尚不明確。本項目在前期建立的LPS誘導BMEC損傷模型的基礎上，給予Nox抑制劑、ROS清除劑處理來研究Nox/ROS信號在LPS致細胞損傷中的作用；然後結合特異性信號轉導抑制劑、激動劑的使用，採用免疫印跡、螢光定量PCR、流式細胞術及雷射共聚焦等技術檢測Nox/ROS信號、NF-κB信號通路、Nrf2信號通路中關鍵信號分子的表達、細胞凋亡及胞核心轉錄因子的定位情況，並探討咖啡酸的干預效應，以此闡明LPS致BMEC損傷的分子機制及咖啡酸的作用靶點，為該製劑的臨床套用提供一定理論依據。
結題摘要
本研究首先最佳化了原代奶牛乳腺上皮細胞（bMEC）的培養方法，採用“一步膠原酶法”簡單、快捷的製備了具有良好細胞活力的原代奶牛乳腺上皮細胞。在前期建立的LPS誘導bMEC結構損傷模型的基礎上，利用NADPH氧化酶（Nox）抑制劑DPI和ROS清除劑NAC探討Nox-ROS信號在LPS誘導的細胞炎症、凋亡中的作用。結果表明，LPS刺激bMEC 12 h後，細胞內ROS蓄積顯著增加，線粒體膜電位顯著降低，但在LPS刺激初期細胞內ROS並未顯著增加，隨著細胞線粒體膜電位的下降，細胞內ROS生成不斷增多，說明細胞內ROS的蓄積主要源於線粒體功能紊亂，且LPS誘導的bMEC凋亡作用主要通過線粒體凋亡途徑。提前孵育NAC、DPI後，LPS誘導的細胞炎症、凋亡明顯減輕，說明Nox-ROS信號在LPS誘導bMEC結構損傷過程中發揮了重要作用，ROS在反應初期發揮了第二信使的作用。相較於bMEC，LPS可引起RAW264.7細胞內ROS迅速生成、線粒體膜電位的迅速降低，炎性因子的大量釋放，導致細胞凋亡；NAC、DPI可顯著抑制細胞內ROS的蓄積，減少炎性因子的釋放，減少細胞的凋亡，說明Nox-ROS信號在bMEC、RAW264.7內的功能有差異。LPS激活了bMEC、RAW264.7的NF-κB、Nrf2信號通路，NF-κB活化可調控細胞產生大量的炎症介質及ROS，促進細胞炎症、氧化應激反應，而活化的Nrf2可調控細胞產生大量的抗炎、抗氧化物質，抑制細胞的炎症、氧化應激反應，但本研究中Nrf2的調控作用並未抑制NF-κB調控的炎症反應及細胞凋亡作用。本研究中咖啡酸（CA）能夠顯著抑制LPS誘導的bMEC、RAW264.7細胞內ROS的蓄積，抑制了細胞NF-κB信號通路活性、增強了Nrf2信號通路活性，從而抑制了LPS誘導的細胞炎症、氧化應激反應，保護了細胞線粒體膜結構及膜電位，抑制了細胞的凋亡作用，作用效果同NAC、DPI類似。說明Nox-ROS信號對細胞NF-κB、Nrf2信號通路具有調節作用；咖啡酸可抑制LPS激活的bMEC Nox-ROS信號，並調節細胞NF-κB、Nrf2信號通路的活化，發揮保護bMEC結構和功能的作用。通過試驗證明，CA能夠明顯抑制LPS誘導的小鼠乳腺炎症、氧化應激，對乳腺結構發揮了保護作用，因此，該研究為CA在大腸桿菌型奶牛乳房炎的套用提供了參考依據。
