基本介紹
- 中文名：吸光光度分析
- 外文名：Ultraviolet-visible Spectrophotometry
- 原理：可見分光光度法
- A為：吸光度
簡介,原理,吸光光度分析方法的誤差來源,螢光和光化學反應的影響,反射和散射效應的影響,光的非單色性帶來的誤差,儀器的組成,
簡介
全自動生化分析儀檢驗血液中各物質含量的分析是吸光光度分析方法的套用之一，根據分析化學中的顯色反應，利用不同的生化試劑把不同物質的含量通過顏色深淺反應出來，再由郎伯-比爾定律定量分析其濃度。
原理
“吸光光度分析方法”又稱“紫外及可見分光光度法（Ultraviolet-visible Spectrophotometry, UV-Vis）”，是根據物質分子對紫外及可見光譜區的吸收特性和吸收程度，對物質進行定性和定量分析的一種吸收光譜法。全自動生化分析儀檢驗血液中各物質含量的分析是吸光光度分析方法的套用之一，根據分析化學中的顯色反應，利用不同的生化試劑把不同物質的含量通過顏色深淺反應出來，再由郎伯-比爾定律定量分析其濃度。
布格（Bouguer）和郎伯（Lambert）先後在1729年和1760年闡明輻射強度和吸收層厚度的關係，1852年比爾（Beer）又提出輻射強度和吸收物濃度也具有類似的關係，這便是著名的布格-郎伯-比爾定律。比爾定律的數學表達式為：
A= = bc (2-1)
式中，A為吸光度，I0為入射輻射強度，It為透過輻射強度，b為吸收層厚度（cm），C為吸收物的摩爾濃度（M），ε為摩爾吸光係數（L﹒mol﹒cm）。此定律廣泛套用於紫外-可見-紅外光譜區吸收測量，全自動生化分析儀中各項生化指標的檢驗也依據於此定律。
比爾定律的成立是以下列條件為前提的：
入射輻射為單色輻射；吸收過程中各物質無相互作用，但各物質的吸光度具有加合性；輻射與物質的作用僅限於吸收過程，沒有螢光、散射和光化學現象；吸收物是一種均勻分布的連續體系。
如偏離以上任意一點，吸光度與濃度（或吸收層厚度）的線性關係將受影響，從而影響分析結果的準確度。其中（2）、（3）由生化分析試劑的特性來保證，（1）由光學系統來保證，（4）由攪拌機構來保證。
吸光光度分析方法的誤差來源
螢光和光化學反應的影響
通常的生化試劑的螢光效率很低，產生的螢光又是各向同性的，只有非常少的一部分沿透射方向進入檢測器，所以螢光的影響是可以忽略的。
採用後分光技術時，即複色光先照射比色池再進入單色器，由於樣品所受的光輻射比較強，有可能發生光化學反應，因此，一方面要儘量減弱入射光的強度，另一方面要選擇不容易發生光化學反應的檢驗試劑。
反射和散射效應的影響
比爾定律成立的前提條件是吸收物是一種均勻分布的連續體系，如果待測液體有渾濁質點，當光輻射通過時會產生散射效應，它對吸光光度分析方法測量的影響表現為光程不確定，散射光的一部分和透射光一起進入檢測器，導致比爾定律的偏離。然而，渾濁的試樣在臨床生化檢驗中是極為常見的，甚至一些檢驗項目本身就是以測量試樣濁度為基礎的，為了減小散射效應的影響，可採取雙波長或三波長分光光度法。
光的非單色性帶來的誤差
比爾定律的重要假設條件之一是入射光為單色光，但是，即使是現代高精度分光光度計，也不可能獲得純單色光。分光光度計單色光的純度主要取決於色散元件和光學系統設計。大多數分光光度計只能獲得近似於單色的狹窄通光帶，它仍然具有複色光的性質，而複色光可導致比爾定律的正或負向偏離
儀器的組成
光源（電源）系統：光輻射與I的4次方成正比
恆溫系統：37
單色器：濾光片、光譜儀
比色池：流動、分立
探測器：光電池、光電倍增管
放大器：高輸入阻抗、低噪聲、電流-電壓變換
數據採集：A/D精度要求，3ABS=1/1000；3ABS-2.999ABS=18位A/D；1ABS-0.999ABS=12位A/D
分析軟體：醫學相關
