《可逆型長壽細胞構建及用於綿羊體細胞基因打靶的研究》是依託中國農業大學，由侯健擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：可逆型長壽細胞構建及用於綿羊體細胞基因打靶的研究
- 依託單位：中國農業大學
- 項目負責人：侯健
- 項目類別：面上項目
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
以體細胞克隆為基礎的家畜基因打靶技術目前存在的最大技術瓶頸是體細胞壽命有限，打靶細胞難以分離、擴增和鑑定。研究證實，表達人端粒酶催化亞基基因（hTERT）可以誘導細胞永生化，但永生化細胞不能用於體細胞克隆。因此，必須構建出細胞壽命可逆的細胞才能用於生產基因打靶動物。為了解決這個問題，本項目在申請人前期研究基礎上，提出建立Cre/loxP系統介導的hTERT可逆表達和細胞壽命可逆調節體系，把該體系用於體細胞基因打靶。項目設計以綿羊細胞為研究材料，擬構建可逆型長壽細胞技術體系，並通過myostatin基因打靶來驗證該體系的效率。本項目的實施有望解決體細胞基因打靶技術的瓶頸問題，對改進家畜基因打靶技術，推動基因打靶技術的發展有重要意義。
結題摘要
在體細胞中進行基因打靶並通過克隆技術生產出動物，目前仍然是實現家畜遺傳修飾的主要技術途徑，但體細胞增殖能力弱造成這一技術體系的效率極低。本項目旨在通過條件性表達外源人端粒酶基因（hTERT）來可逆延長體細胞壽命，以提高體細胞基因修飾的技術效率。通過本項目的實施，我們已完成項目全部研究內容，實現了預期目標。所取得的主要研究結果如下：1. 建立了Cre/loxP系統介導的條件性表達hTERT基因的方法，並在綿羊胎兒成纖維細胞中驗證了這一系統的效果；2. 建立了Tet-on系統介導的可誘導表達hTERT基因的方法，並在綿羊胎兒成纖維細胞和成年羊皮膚成纖維細胞中驗證了這一系統的效果；3.在hTERT誘導長壽的細胞中進行轉基因實驗，結果表明誘導長壽細胞轉染外源基因（myoD）後單克隆細胞存活率達到78.5%，顯著高於非長壽細胞（51.6%）；4. 探索了鋅指核酸酶（ZFN）敲除綿羊肌肉抑制素myostatin基因的技術，並建立了Tet-on系統介導的條件性表達ZFN的方法，得到了myostatin基因突變的綿羊胎兒成纖維細胞系；5. 建立了CRISPR/Cas9基因打靶方法，得到了基因打靶的小鼠；6. 在誘導長壽的綿羊成年體細胞中利用CRISPR/Cas9技術進行了基因打靶，證實打靶後單細胞克隆存活率達到57.8%。上述結果表明，本項目建立的條件性表達hTERT的方法可以顯著延長綿羊原代細胞的壽命，實現對細胞壽命的可逆調節，並提高細胞轉基因和基因打靶的效率。本項目研究結果對改良動物遺傳修飾技術體系有重要意義。
