《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》是華南理工大學於2009年6月1日申請的發明專利，該專利申請號為2009100398605，公布號為CN101565713，專利公布日為2009年10月28日，發明人是林影、韓雙艷、蘇國棟、鄭穗平、黃登峰。
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》中改良的南極假絲酵母B其編碼的蛋白與野生型南極假絲酵母脂肪酶蛋白在胺基酸水平具有相同的功能；將其基因轉入到畢赤酵母宿主菌中，實現南極假絲酵母脂肪酶B在畢赤酵母中的高效展示表達，能廣泛套用於合成己酸乙酯、糖脂，具有不同熔點，且不含各式脂肪酸的三甘酯以及一些“重構脂”等。
2017年12月11日，《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
基本介紹
- 中文名：南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用
- 公布號：CN101565713
- 公布日：2009年10月28日
- 申請號：2009100398605
- 申請日：2009年6月1日
- 申請人：華南理工大學
- 地址：廣東省廣州市天河區五山路381號
- 發明人：林影、韓雙艷、蘇國棟、鄭穗平、黃登峰
- 代理機構：廣州粵高專利商標代理有限公司
- 代理人：何淑珍
- Int.Cl.：C12N15/55(2006.01)I; C12N15/63(2006.01)I; C12N15/81(2006.01)I; C12N1/19(2006.01)I
- 類別：發明專利
專利背景,發明內容,專利目的,技術方案,改善效果,技術領域,權利要求,實施方式,榮譽表彰,
專利背景
來源於南極假絲酵母（Candidaantarctica）的南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）是一類重要的脂肪酶，在酯化、水解、轉酯、以及其它類型反應中都顯示了較其它脂肪酶更為出色的催化性能。然而，游離脂肪酶對溫度及有機溶劑的穩定性較差，反應產物分離困難，難以適應不同工業生產條件的需求。利用酵母表面展示技術，外源脂肪酶可藉助於錨定在細胞壁的載體蛋白固定在酵母細胞表面，類似酶的固定化，保持了脂肪酶相對獨立的空間構象和原有的生物活性，表現出耐溫、耐有機溶媒以及熱穩定性好等優良特性，如天然的米根霉脂肪酶（Rhizopusoryzaelipase，ROL）在有機溶劑中是不能催化對映體拆分的，而展示的ROL卻可以催化對映體拆分。
脂肪酶蛋白酵母表面展示技術可以在標準的發酵過程中實現酶在酵母細胞表面的固定（展示），不僅保留了固定化酶回收方便、可重複使用的優點，更省去了酶的分離純化以及固定化等步驟，有望成為酶固定化的替代方法之一。
基於CALB的優良特性，人們對其進行了商業化的開發，但高成本依然限制了CALB廣泛套用於實踐生產。2009年前後，日本的研究學者嘗試將野生型CALB展示於釀酒細胞表面，但酶在釀酒酵母細胞表面展示後表現出催化效率偏低，成為制約其發展的瓶頸。
畢赤酵母具有受甲醇調控的AOX1基因強啟動子，能夠穩定展示糖基化和二硫鍵異構化等修飾的真核蛋白，較釀酒酵母而言，更具有表達量高，胞外表達本底蛋白少等優點。畢赤酵母展示與釀酒酵母展示相比，畢赤酵母更易實現高密度培養，因此一般可獲得高於釀酒酵母的酶產量。截至2009年6月報導畢赤酵母表面展示的脂肪酶較少，這與畢赤酵母表面展示系 統開發較晚，載體系統不成熟，展示能力不穩定有關。具體到CALB的展示，發明人（Shuang—yanHan，etal.Highlyefficientsynthesisofethylhexanoatecatalyzedby CALB—displayingSaccharomycescerevisiaewhole—cellsinnon—aqueousphase，Journalof MolecularCatalysisB：Enzymatic，2009，59：168—172）已將未修飾的原始CALB基因在釀酒酵母表面展示，酶水解活力為17U/g幹細胞，產量低，限制了其作為全細胞催化劑的套用和CALB脂肪酶酶製劑的開發。因而急需在增加酶的展示量、尋找更合適的展示宿主，以及改良展示酶的催化特性等方面的研究完善，為其套用奠定基礎。
發明內容
專利目的
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》的目的在於克服截至2009年6月前，脂肪酶展示催化效率低，提供一種能在畢赤酵母表面高效展示的南極假絲酵母脂肪酶B（CALB）的基因序列。
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》的第二個目的是提供上述基因序列克隆的載體。
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》的第三個目的是提供指導CALB展示表達在畢赤酵母細胞表面的重組質粒載體。
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》的第四個目的是提供具有上述基因序列的能展示高活力CALB的畢赤酵母工程菌。
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》提供的南極假絲酵母脂肪酶核苷酸序列，利用基因工程的方法，實現該基因在畢赤酵母細胞表面的高效的展示，以提高脂肪酶在細胞表面的展示量和熱穩定性，從而提供一種高效率，耐熱脂肪酶，降低脂肪酶生產成本。
技術方案
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》的目的是通過以下技術方案實現：
（1）畢赤酵母中高效表達的改良CALB基因
根據已報導的南極假絲酵母脂肪酶B的三維結構，結合生物信息學計算，設計多個胺基酸的突變和不同突變位點的組合，建立野生型CALB的突變庫，通過熱穩定性、酶活力篩選，發現對野生型的CALB（Genbank： Z30645，來源於南極假絲酵母LF058株）的胺基酸序列設計如下突變，Pro226Asn， Leu227Lys，Phe228Thr，Val229Ser，Leu285Gly，Ala286Met，Ala288Ile，改良後CALB具體的胺基酸序列為SEQ.ID.NO1，突變後的CALB耐熱性顯著提高，75℃保溫16小時時，活力降低50％，較野生型75℃半衰期為8小時提高1倍。進一步利用畢赤巴斯德酵母菌的偏好密碼子置換出野生型CALB基因中稀有密碼子，序列具與SEQ.ID.NO2從核苷酸第1—978位具有85％的同源性。上述的改良CALB基因可以通過化學法（β—乙腈亞磷酸胺化學合成法），使用全自動合成儀合成，該體外使用核酸自動合成儀合成的DNA分子，編碼與野生型CALB蛋白在胺基酸水平上有7個位點不同，但具有相同功能和不同催化能力的核苷酸序列。
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》中人工合成改良脂肪酶基因工作可以通過專門的生物技術公司或機構（如深圳 華大基因科技有限公司、上海生工生物工程公司）採用核酸自動合成儀以及PCR拼接方法完成。
（2）具有上述基因序列克隆的載體的構建
利用Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，將獲得的改良脂肪酶基因PCR產物與T載體在連線酶作用下實現體外連線，轉化大腸桿菌感受態，塗平板培養過夜，進行藍白斑篩選，挑選的陽性克隆提質粒經測序驗證。克隆脂肪酶基因用的T載體可以是市售通用的任意T載體，如pUC57、pGEM—T、PMD18—T、PMD19—T等。《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》選用了pUC—57，獲得了攜帶改良CALB基因的質粒載體pUC57—CALB。
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》所述基因的重組載體CCTCCM209081，其中RML是指脂肪酶基因序列；攜帶該質粒的菌株大腸桿菌DH5α/pUC57—CALB（Escherichiacoli DH5α/pUC57—CALB）於2009年4月22日在中國典型培養物保藏中心保藏，保藏號為：CCTCCNO：M209081。保藏地址為 湖北省武漢市武漢大學（430072）。
（3）脂肪酶展示表達到酵母細胞外的重組質粒載體的構建
為實現改良CALB在畢赤巴斯德酵母中的展示表達，採用pKFS（申請號 200810028631.9，此展示載體在pPIC9K（Invitrogen公司真核表達載體）的基礎上利用限制性內切酶EcoRI和NotI將原載體上的信號肽部分基因切除，在此基礎上用來源於釀酒酵母的絮凝素基因FS替換。該質粒主要包含5’AOX1、3’AOX、FS（絮凝素基因）、HIS4，以及Amp、Kna等元件，同時包含可用來克隆脂肪酶基因的多克隆位點，包括限制性內切酶酶切位點MuI、ApaI、SacII、EcoRI、AvrII、NotI）為克隆表達載體。去除了RML上游編碼自身信號肽的24個胺基酸對應的序列，以利用pKFS的絮凝素基因FS展示外源蛋白。 根據GenBank中已報導的南極假絲酵母脂肪酶B序列（GenBank：Z30645.1），克隆CALB基 因時去除了CALB上游編碼自身信號肽的18個胺基酸以及前導肽7個胺基酸對應的核苷酸序列，以利用pKFS的絮凝素基因FS展示外源蛋白。根據上述思路設計引物P1為5’TAGAATTCGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTC（框內部分為EcoRI酶切位點），引物P2 5’TATGCGGCCGCTCAGGGGGTGACGATG（框內部分為NotI酶切位點）。
以質粒pUC57—CALB為模板，P1和P2為引物進行PCR擴增。將PCR產物和pKFS質粒都用EcoRI和NotI雙酶切，體外連線構建重組質粒pKFS—CALB。
（4）提供具有上述基因序列的高表達南極假絲酵母脂肪酶B的畢赤酵母工程菌
以LiCl法將SalI線性化的重組質粒pKFS—CALB轉化畢赤巴斯德酵母宿主菌GS115或KM71，轉化物塗布於MD平板，培養2—3天。將MD平板上的轉化子分別接種於含不同濃度的G418抗性YPD平板上，培養3—5天。將高濃度G418—YPD平板上出現的轉化子挑取其對應的單克隆，按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作為模板，進行酵母基 因組PCR鑑定，獲得重組轉化子。
重組轉化子先接種於200毫升的YPD培養基中，培養至OD600到8—12作為種子液。培養種子液8—10瓶，然後以5—10％的接種量（體積比）轉接至含20—35LBSM培養基的50L發酵罐中培養，甘油耗完後再補加5—8L50％（體積比，1∶1）的甘油，至二次甘油消耗完，OD600達280—320左右，飢餓0.5—1小時後，補料甲醇，甲醇流加速度為30克/升·小時—60克/升·小時，溶氧控制在5—10％，氨水自動流加，發酵120—140小時後結束，展示在畢赤酵母表面CALB水解對硝基苯酚丁酸酯的高達130U/g酵母幹細胞。
含有表達載體pKFS—CALB轉化的畢赤巴斯德酵母可用於短鏈芳香酯、生物柴油以及糖苷類的催化合成。
改善效果
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》採用酵母表面展示系統表達酶，在保持酶高活力、高催化性能的同時，相比游離酶或固定化酶省略了純化分離的繁瑣步驟，更具有固定化酶的優點，可以反覆使用，操作穩定性強。脂肪酶套用於生產實踐時，除對高酶活有要求外，對酶的耐熱性也是重點強調的內容，《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》利用生物信息學，結合定向進化手段，獲得突變的CALB活力可耐75℃高溫，最適作用溫度為55℃，較野生型的最適溫度提高了10℃。同時考慮到酵母表達非同種、非同屬的外源基因時，也表現出來了產量不高，表達能力降低的問題，針對畢赤酵母表達系統合成適合其表達的RML基因，解決了上述問題，實現了酶的高表達，表達活力高達130U/g酵母幹細胞，為截至2009年6月已有報導的最高水平。
技術領域
《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》涉及一種能在畢赤巴斯德酵母中高效表達南極假絲酵母脂肪酶B的改良基因序列和展示有高活力脂肪酶的酵母菌，以及從該重組酵母中得到的基因工程脂肪酶。
權利要求
1、《一種南極假絲酵母脂肪酶B基因》其特徵在於，其編碼的蛋白與野生型南極假絲酵母脂肪酶蛋白在胺基酸水平具有相同的功能，其酶的耐熱能力為50—80℃，半衰期為3小時—24小時，所述的核苷酸序列在中度嚴謹條件下與SEQ.ID.NO2從核苷酸第1—978位雜交。
2、根據權利要求1所述的南極假絲酵母脂肪酶B基因，其特徵在於，按照畢赤酵母偏好密碼子設計核苷酸序列，南極假絲酵母脂肪酶B基因具有與SEQ.ID.NO2從核苷酸第1—978位85％的同源性。
3、一種含有權利要求1所述南極假絲酵母脂肪酶B基因的重組載體pUC57—CALB，其中CALB是指權利要求1所述的脂肪酶基因序列；攜帶該質粒的大腸桿菌DH5α/pUC57—CALB（EscherichiacoliDH5α/pUC57—CALB）的保藏號為：CCTCCNO：M209081。
4、一種含有權利要求1所述基因的重組質粒pKFS—CALB，其中CALB是指權利要求1所述的脂肪酶基因；以重組載體pUC57—CALB為模板，設計引物，PCR擴增CALB後利用分子克隆技術構建重組質粒pKFS—CALB。
5、一種由權利要求4所述的重組質粒pKFS—CALB所轉化的畢赤酵母菌，其特徵在於，將表達載體pKFS—CALB轉化入畢赤巴斯德酵母。
6、一種含有權利要求5表達載體pKFS—CALB轉化的畢赤巴斯德酵母短鏈芳香酯、生物柴油以及糖苷類的催化合成中的套用。
實施方式
實施例1：改良米黑根毛霉脂肪酶基因的合成
2009年6月前的南極假絲酵母脂肪酶B（Genbank：Z30645，來源於南極假絲酵母LF058株），其基因如SEQ.ID.NO3所示，而南極假絲酵母對密碼子的偏好性與畢赤酵母存在一定差距。該發明首先藉助生物信息學預測，對野生型南極假絲酵母脂肪酶B實現不同位點、不同胺基酸的飽和突變，之後通過定向進化和高通量篩選，篩到1株酶活力和耐熱性均提高的菌株，通過測序，發現相對野生型的CALB的胺基酸序列有如下突變，Pro226Asn，Leu227Lys，Phe228Thr，Val229Ser，Leu285Gly，Ala286Met，Ala288Ile，改良後的CAL具體的胺基酸序列為SEQ.ID.NO1，在此基礎上，採用畢赤巴斯德酵母偏好的密碼子替換CALB在畢赤酵母中使用頻率低的密碼子，設計出在畢赤巴斯德酵母中使用頻率高的基因序列，形成以下具體的基因序列，如SEQ.ID.NO2，從而提高CALB在畢赤酵母中的表達量。該發明提供的基因序列可以通過專門的生物技術公司或機構使用全自動合成儀合成。
實施例2：pUC-CALB質粒的構建
上步獲得的全合成基因可與pUC57進行TA克隆實現體外連結，可按照說明書進行操作。10微升體積反應體系如下：T載體1微升（50納克），加入全合成基因產物3微升，含ATP的10×Buffer1微升，T4DNA連線酶1微升，用ddH2O補足至10微升。稍加離心，16℃水浴連線過夜。連線產物轉化E.coliDH5α，然後塗布到含0.5米 MIPTG，40μg/毫升 X-Gal指 示平板上，過夜培養，挑選白斑提取質粒酶切鑑定後，將重組質粒PMD18-T-RML送上海生工生物工程有限公司測序，測序表明克隆的基因與發明者所述的全合成基因一致。
實施例3：重組質粒pKFS-CALB的構建
以質粒pUC57-CALB為模板，P1和P2為引物進行PCR擴增。體系為模板1微升；10×Taq DNA聚合酶buffer5微升（含Mg）；2.5 dNTP 4微升；20微摩爾/升的引物各1微升；TaqDNA聚合酶0.75微升，加無菌水至總體積為50微升。反應條件為：94℃預變性5分鐘；94℃變性45秒，45℃退火45秒，72℃延伸2分鐘，共30個循環；第30個循環72℃延伸10分鐘，PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測並切膠回收純化。
將全合成基因的PCR產物和pKFS質粒都用EcoRI和NotI雙酶切，進行體外連線。20微升體積反應體系如下：pKFS質粒2微升（50納克），PCR產物15微升（50納克），10×Buffer 2微升，T4DNA連線酶1微升。16℃水浴連線過夜後，去連線產物10微升用CaCl2轉化法轉入E.coliTop10F，在AmpLB（50毫克/毫升）平板上塗板，提取陽性轉化子質粒進行EcoRI和NotI雙酶切鑑定。鑑定正確後，同樣委託上海生工生物工程有限公司進行測序。
實施例4：表達高活力脂肪酶的畢赤酵母工程菌的培養
以LiCl法將SalI線性化的重組質粒pKFS-CALB轉化宿主菌GS115，轉化物塗布於MD平板，30℃培養2d。將MD平板上的轉化子分別接種於含G4180.5毫克/毫升，1.0毫克/毫升，1.5毫克/毫升，2.0毫克/毫升，3.0毫克/毫升的YPD平板上，30℃培養3d。將高濃度G418-YPD平板（3.0毫克/毫升）上出現的轉化子挑取單克隆。按Invitrogen操作指南提取酵母基因組DNA作為模板，利用目的基因序列的PCR引物進行酵母基因組PCR鑑定，總反應體積為20微升， Taq酶量為2U，取2微升PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳鑑定。
鑑定正確的重組轉化子GS115/p KFS-CALB先接種於200毫升的YPD培養基中，培養至OD600到10作為種子液。培養種子液8瓶，然後以5％的接種量（體積比）轉接至含30L BSM培養基的50L發酵罐中培養，甘油耗完後再補加6L50％（質量體積比）的甘油，至二次甘油消耗完，OD600達300，飢餓半小時後，補料甲醇，甲醇流加速度為30克/L·h- 60克/L·h，溶氧控制在5-10％，氨水自動流加，發酵120小時後結束。
發酵液在7000轉/分鐘、4℃離心10分鐘，棄上清，用去離子水洗滌菌體三次，重懸菌體經真空冷凍乾燥24小時，得菌體凍乾粉。利用對硝基苯酚丁酸酯（PNPB）做底物進行NaOH法滴定測定脂肪酶水解活力，結果顯示該脂肪酶活力高達130U/g酵母幹細胞，比2009年6月前技術（T.Tanino，T.Ohno，T.Aoki，H.Fukuda，A.Kondo，Developmentofyeastcellsdisplaying CandidaantarcticalipaseBandtheirapplicationtoestersynthesisreactionAppl. Microbiol.Biotechol.2007，75：1319-1325）報導的釀酒酵母展示的CALBCBS6678的 酶活力（20.4U/g酵母幹細胞）提高近6倍。
1個酶活力單位定義為每分鐘水解底物對硝基苯酚丁酸酯生成1微摩爾對硝基苯酚所需的酶量。
實施例5：葡萄糖月桂酸酯的合成
採用葡萄糖和月桂酸為原料，使用有機溶劑叔戊醇和二甲基亞碸，在畢赤酵母細胞表面展示的南極假絲酵母脂肪酶作用下發生酯化反應，得到糖酯產品。
有機溶劑叔戊醇和二甲基亞碸（4毫升的叔戊醇，1毫升的二甲基亞碸）預先用分子篩充分除水。取底物0.595克葡萄糖，1.2克月桂酸（醯基供體和醯基受體摩爾比為2∶1）於25毫升具塞三角瓶中，在55度下預熱20分鐘，然後加入0.3克（約39U）畢赤酵母工程菌菌體凍乾粉（實施例4製備的），反應溫度55℃，然後於200轉/分鐘下振盪反應72小時。反應完成後離心取上清，然後上高效液相色譜定量分析（液相色譜：waters2695；檢測器蒸發光散色檢測器 2424；柱子：C18柱），最終葡萄糖酯的產率為70％。
實施例6：果糖月桂酸酯的合成
採用果糖和月桂酸為原料，使用有機溶劑叔戊醇和二甲基亞碸，在畢赤酵母細胞表面展示的南極假絲酵母脂肪酶作用下發生酯化反應，得到糖酯產品。
有機溶劑叔戊醇和二甲基亞碸（4毫升的叔戊醇，1毫升的二甲基亞碸）預先用分子篩充分除水。取底物：0.54克果糖，1.2克月桂酸（醯基供體和醯基受體摩爾比為2∶1）於25毫升具塞三角瓶中，在55℃下預熱20分鐘，然後加入0.2克（約26U）畢赤酵母工程菌菌體凍乾粉，反應溫度55℃，然後於200轉/分鐘下振盪反應72小時。反應完成後離心取上清，然後上高效液相色譜定量分析（液相色譜：waters2695；檢測器蒸發光散色檢測器2424；柱子：C18柱），最終果糖的產率為80％。
實施例7：油酸甲酯的合成
採用大豆油和甲醇為原料，使用有機溶劑異辛烷（2毫升），在畢赤酵母細胞表面展示的南極假絲酵母脂肪酶作用下發生轉酯反應，得到脂肪酸甲酯產品。
異辛烷（2毫升）預先用分子篩除水。向25毫升具塞錐形瓶中加入0.965克大豆油和0.0525克甲醇（摩爾比為1），放於40℃的恆溫空氣搖床（200轉/分鐘）中預熱20分鐘，然後加入0.2克（約26U，實施例4製備）實施例4的畢赤酵母工程菌菌體凍乾粉開始反應。反應溫度55℃，然後於200轉/分鐘下振盪反應，在反應24小時和48小時後分別加入0.0525克甲醇（最終醇油摩爾比為3∶1），反應72小時，反應完成後離心取上清，然後上氣相色譜分析（氣相色 譜：安捷倫7890C；檢測器：氫離子檢測器；柱子：DB-FFAP毛細管柱），最終脂肪酸甲酯產率為65％。
實施例8：非水相酯化反應製備己酸乙酯
試劑都預先用分子篩充分除水。在25毫升具塞三角瓶中加入4.604毫升的正庚烷，375微升的正己酸（終濃度0.6M）和實施例4的畢赤酵母工程菌菌體凍乾粉（0.1克，約13U）放於40度的恆溫搖床中預熱10分鐘，然後加入219微升無水乙醇（反應體系中，正己酸與乙醇的摩爾比為1∶1.25），在40度搖床中反應，搖床轉速為200轉/分鐘。當反應時間為0.5小時和5小時時，分別加入0.6克和0.3克分子篩，反應6小時，己酸的轉化率能達到95％。在上述條件下反應後，離心回收菌體，經溶劑正庚烷洗滌，去除產物和殘餘的微量底物，再加入到含有新鮮底物的反應體系中催化酯化反應，經過10批次的連續使用，畢赤酵母展示CALB仍然在每批次中使己酸的轉化率保持在95％以上。
由實施例5、6、7、8可見，套用實施例4製備的畢赤酵母工程菌菌體凍乾粉均能催化糖脂、油酸甲酯以及己酸乙酯的合成，由於該菌體凍乾粉作為催化劑，與游離酶和固定化酶相比，省去了分離純化的繁瑣步驟，易於製備，生產周期短，操作穩定性強，有利於降低生產成本，並實現規模化套用。
SEQ.ID.NO1：（改良後的南極假絲酵母的胺基酸序列，劃線部分標出的是與Genank中提供（Z30645）的不一致之處）
MATPLVKRLP SGSDPAFSQP KSVLDAGLTC QGASPSSVSK PILLVPGTGT TGPQSFDSNW
IPLSAQLGYT PCWISPPPFM LNDTQVNTEY MVNAITTLYA GSGNNKLPVL TWSQGGLVAQ
WGLTFFPSIR SKVDRLMAFA PDYKGTVLAG PLDALAVSAP SVWQQTTGSA LTTALRNAGG
LTQIVPTTNL YSATDEIVQP QVSNSPLDSS YLFNGKNVQA QAVCGNKTSI DHAGSLTSQF
SYVVGRSALR STTGQARSAD YGITDCNPLP ANDLTPEQKV AAAALGMPIA AAIVAGPKQN
CEPDLMPYAR PFAVGKRTCS GIVTP*
SEQ.IDNO2：（改良後的南極假絲酵母DNA序列，包括了AA突變和密碼子偏好）
ATGGCTACTCCATTGGTTAAGAGATTGCCATCTGGTTCTGATCCAGCTTTTTCTCAACCAAAGTCTG
TTTTGGATGCTGGTTTGACTTGTCAAGGTGCTTCTCCATCTTCTGTTTCTAAGCCAATTTTGTTGGTT
CCAGGTACTGGTACTACTGGTCCACAATCTTTTGATTCTAACTGGATTCCATTGTCTGCTCAATTGGG
TTACACTCCATGTTGGATTTCTCCACCACCATTTATGTTGAACGATACTCAAGTTAACACTGAATACA
TGGTTAACGCTATTACTACTTTGTACGCTGGTTCTGGTAACAACAAGTTGCCAGTTTTGACTTGGTC
TCAAGGTGGTTTGGTTGCTCAATGGGGTTTGACTTTTTTTCCATCTATTAGATCTAAGGTTGATAGAT
TGATGGCTTTTGCTCCAGATTACAAGGGTACTGTTTTGGCTGGTCCATTGGATGCTTTGGCTGTTTCT
GCTCCATCTGTTTGGCAACAAACTACTGGTTCTGCTTTGACTACTGCTTTGAGAAACGCTGGTGGTT
TGACTCAAATTGTTCCAACTACTAACTTGTACTCTGCTACTGATGAAATTGTTCAACCACAAGTTTC
TAACTCTCCATTGGATTCTTCTTACTTGTTTAACGGTAAGAACGTTCAAGCTCAAGCTGTTTGTGGT
AACAAGACTAGTATTGATCATGCTGGTTCTTTGACTTCTCAATTTTCTTACGTTGTTGGTAGATCTGC
TTTGAGATCTACTACTGGTCAAGCTAGATCTGCTGATTACGGTATTACTGATTGTAACCCATTGCCAG
CTAACGATTTGACTCCAGAACAAAAGGTTGCTGCTGCTGCTTTGGGTATGCCAATTGCTGCTGCTAT
TGTTGCTGGTCCAAAGCAAAACTGTGAACCAGATTTGATGCCATACGCTAGACCATTTGCTGTTGGT
AAGAGAACTTGTTCTGGTATTGTTACTCCATAA//
SEQ.ID.NO3：野生型的南極假絲酵母的DNA序列：
ATGGCCACTCCTTTGGTGAAGCGTCTGCCTTCCGGTTCGGACCCTGCCTTTTCGCAGCCCAAGTCG
GTGCTCGATGCGGGTCTGACCTGCCAGGGTGCTTCGCCATCCTCGGTCTCCAAACCCATCCTTCTCG
TCCCCGGAACCGGCACCACAGGTCCACAGTCGTTCGACTCGAACTGGATCCCCCTCTCTGCGCAGC
TGGGTTACACACCCTGCTGGATCTCACCCCCGCCGTTCATGCTCAACGACACCCAGGTCAACACGG
AGTACATGGTCAACGCCATCACCACGCTCTACGCTGGTTCGGGCAACAACAAGCTTCCCGTGCTCA
CCTGGTCCCAGGGTGGTCTGGTTGCACAGTGGGGTCTGACCTTCTTCCCCAGTATCAGGTCCAAGG
TCGATCGACTTATGGCCTTTGCGCCCGACTACAAGGGCACCGTCCTCGCCGGCCCTCTCGATGCACT
CGCGGTTAGTGCACCCTCCGTATGGCAGCAAACCACCGGTTCGGCACTCACTACCGCACTCCGAAA
CGCAGGTGGTCTGACCCAGATCGTGCCCACCACCAACCTCTACTCGGCGACCGACGAGATCGTTCA
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榮譽表彰
2017年12月11日，《南極假絲酵母脂肪酶B基因及其在酵母展示中的套用》獲得第十九屆中國專利優秀獎。
