《脂肪酶水解甘油三酯位置選擇性的調控和分子機制研究》是依託吉林大學，由於大海擔任項目負責人的青年科學基金項目。
基本介紹
- 中文名：脂肪酶水解甘油三酯位置選擇性的調控和分子機制研究
- 項目類別：青年科學基金項目
- 項目負責人：於大海
- 依託單位：吉林大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
利用脂肪酶的位置選擇性，催化製備的位置異構體化合物是許多藥物和保健品的關鍵成分。位置選擇性是脂肪酶重要的底物選擇性參數，然而目前脂肪酶結構和位置選擇性的關係尚不清楚，因此，研究脂肪酶的位置選擇性具有重要的科研和套用價值。本課題針對脂肪酶對甘油三酯三條脂肪酸側鏈位置選擇性不同的性質，以酶催化甘油三酯水解反應為模型，擬通過定向進化和合理設計相結合的手段，以對甘油三酯無位置選擇性的南極假絲酵母脂肪酶基因為模板，建立突變基因庫，結合課題組建立的酶位置選擇性高通量篩選方法，對酶的位置選擇性進行最佳化，篩選得到具有sn2位置選擇性的突變酶。通過對野生型和突變酶結構的分析，對酶位置選擇性進行合理設計，進一步最佳化酶的位置選擇性。探討脂肪酶結構和位置選擇性的關係，用理論計算和動力學方法分析脂肪酶位置選擇性的分子機制。為對脂肪酶結構進行有效調控，獲得具有特殊位置選擇性的新酶提供理論和實驗依據。
結題摘要
位置選擇性是脂肪酶重要的底物選擇性參數，然而目前脂肪酶結構和位置選擇性的關係尚不清楚，因此，研究脂肪酶的位置選擇性具有重要的科研和套用價值。在本課題中我們針對南極假絲酵母脂肪酶B對甘油三酯三條脂肪酸側鏈位置選擇性不同的性質，以該酶催化不同鏈長甘油三酯水解反應為模型，通過疊代飽和突變技術和組合的活性位點飽和突變技術等半合理設計和合理設計相結合的手段，通過以對短鏈甘油三酯無位置選擇性的南極假絲酵母脂肪酶B基因為模板，建立突變基因庫。通過密碼子簡併設計進一步提高了篩選效率。結合課題組建立的甘油銅類酶位置選擇性高通量篩選方法，對酶的底物鏈長選擇性和位置選擇性進行了最佳化，篩選得到了具有sn2位置選擇性的突變酶。通過對野生型和突變體酶結構的分析，以及對酶位置選擇性進行的合理設計，進一步最佳化了酶的位置選擇性。我們通過探討脂肪酶結構和位置選擇性的關係，發現南極假絲酵母脂肪酶B底物適應性廣，對不同鏈長的甘油酯類都具有活性和特異性，而且其特異性隨著底物鏈長不同而變化。我們還發現底物活性中心口袋大小和排布方式對該酶位置選擇性其關鍵作用。活性中心口袋擴大有利於提高長鏈甘油酯的活性和位置選擇性，但使短鏈甘油酯位置選擇性降低。另外活性口袋中底物結合部位的排布對該酶的位置選擇性取決定性作用，sn2位置選擇性突變酶的底物結合區域要明顯小於sn1,3，和sn1,2,3型的結合區域。我們推測把sn1,3，和sn1,2,3位置選擇性酶的活性口袋區域減小，並使之能夠有效結合sn2位置的底物可能是轉變酶位置選擇性的有效途徑。我們的研究為對脂肪酶結構進行有效調控，獲得具有特殊位置選擇性的新酶提供了理論和實驗依據。
