利用microRNA在植物中進行病毒誘導的基因沉默研究

《利用microRNA在植物中進行病毒誘導的基因沉默研究》是依託清華大學，由劉玉樂擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：利用microRNA在植物中進行病毒誘導的基因沉默研究
• 依託單位：清華大學
• 項目負責人：劉玉樂
• 項目類別：面上項目

項目摘要

病毒誘導的基因沉默（VIGS）是一種快速高效的研究植物基因功能的工具，傳統VIGS通常被認為通過多種混合siRNA起作用，因而該技術有一個顯著的局限：可能導致非特異的基因沉默。microRNA是另一種可負調控基因表達的小RNA分子。通過過表達人工設計的microRNA基因有可能克服基因沉默的潛在非特異性；此外大量的植物內源microRNA已被鑑定和預測，但大多數功能不清楚；研究植物內源microRNA的功能的重要方法之一是過表達這些microRNA基因，目前過表達主要是通過植物轉基因來實現的，而植物轉基因耗時費力，在一些植物上極其困難。本研究擬利用植物DNA病毒發展病毒載體，並探索用病毒載體進行microRNA介導的基因沉默的可行性，一旦成功，將為快速特異地沉默特定基因和快速研究植物microRNA的功能提供新的工具。

結題摘要

miRNA在各種生物中的各類生物過程中都扮演著非常重要的角色。植物中的多個miRNA已經通過實驗或者生物信息學的方法得到鑑定和預測。然而，由於缺少有效的遺傳學研究工具，這些miRNA的功能大多都是未知的，因此，開發能快速有效研究miRNA功能的遺傳學工具的需求就變得非常緊迫。我們在本課題的支持下首先開發了一個基於捲心菜卷葉雙生病毒（Calcrv）載體，該載體既可用於在植物中表達內源miRNA，也可用於表達人工miRNA。我們運用該基於病毒的miRNA表達系統（MIR VIGS），證明了通過表達人工miRNA可以非常有效的在本生菸草中沉默PDS，Su，CLA1，和SGT1等基因。沉默SGT1導致了N基因介導的對TMV抗性的丟失。此外，我們還利用MIR VIGS系統異源過表達了miR156和miR165， 均產生了發育不正常的表型。異源過表達miR165還可誘導菸草葉片產生黃斑。由此，我們開發的MIR VIGS系統不僅可以用來沉默代謝和抗性相關的基因，也可以用於研究植物內源的miRNA。其次，我們對菸草脆裂病毒（TRV）進行改造構建了一個用來在植物中異源過表達RNA的載體。我們利用該載體表達miRNA的靶標模擬序列來沉默植物內源miRNA，並將該系統命名為病毒介導的miRNA沉默系統（VbMS）。在菸草中我們利用VbMS系統成功沉默了miR165/166和miR172，都出現了發育表型。而利用VbMS在番茄中沉默miR319使其複葉複雜度降低。以上結果表明，基於TRV的VbMS系統是一個功能強大的在植物中用於研究miRNA功能的工具。