《利用人工啟動子庫最佳化乳酸乳球菌丙酮酸代謝途徑》是依託山東大學，由孔健擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：利用人工啟動子庫最佳化乳酸乳球菌丙酮酸代謝途徑
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：孔健
- 依託單位：山東大學
中文摘要,結題摘要,
中文摘要
利用代謝工程改造乳酸菌使其產生有效代謝產物成為乳酸菌研究的重要方向。丙酮酸是乳酸菌代謝途徑中的重要中間產物，控制其代謝流向使之轉化成雙乙醯有助於提高發酵乳製品的風味，但僅憑傳統基因敲除或過量表達等手段在代謝控制分析中具有一定局限性。本研究擬對乳球菌中控制Nisin生物合成的啟動子PnisA進行人工改造，利用簡併引物對啟動子的非保守區隨機突變，獲得突變位點不同的啟動子序列，建立人工啟動子庫；以綠色螢光蛋白為報告基因，通過檢測螢光量確定啟動子表達強弱，利用RT-qPCR技術在轉錄水平上進一步確定啟動子的強度及穩定性。在此基礎上，選擇不同強度的啟動子，分別表達控制丙酮酸代謝流向的關鍵酶NADH氧化酶基因（noxE），最佳化丙酮酸轉化為雙乙醯的最佳條件，實現乳球菌丙酮酸從乳酸發酵向雙乙醯代謝的部分轉化，以獲得既產乳酸又產雙乙醯的優良菌株。同時該技術的成功也為乳酸菌其它代謝途徑的改造奠定基礎。
結題摘要
利用代謝工程改造乳酸菌使其產生有效代謝產物成為乳酸菌研究的重要方向，傳統的基因敲除或過量表達難以合理分配和最佳化代謝途徑，利用啟動子活性調解基因的表達強度是目前遺傳改造中常用的操作手段。乳鏈菌素啟動子是目前乳酸菌使用最為廣泛的構建表達系統的遺傳元件，使用兼併引物隨機突變乳酸乳球菌HSM-22乳鏈菌素合成基因啟動子PnisZ-2，建立了包括35個誘導型啟動子和14個組成型的啟動子庫，強度跨越3-5個數量級，並且相鄰啟動子強度變化較小。序列分析發現，在-35和-10區域內鹼基的任何變化均能導致啟動子強度的降低，而在啟動子以外的鹼基變化則隨機影響啟動子的功能。 NADH氧化酶催化NADH轉化為DAD+，NADH氧化酶活性的增強促使乳酸乳球菌由同型乳酸發酵轉化為混合酸發酵。克隆乳酸乳球菌MG1363 NADH氧化酶啟動子O159，採用上述同樣兼併引物設計法，建立了NADH氧化酶啟動子庫，並在綠色螢光蛋白mRNA轉錄水平和β-半乳糖苷酶蛋白表達水平上證實了該啟動子庫的有效性和穩定性。利用強度不同的組成型啟動子精確調控了乳球菌細胞內NADH/NAD+比例，實現了丙酮酸代謝流向雙乙醯合成途徑的部分轉化，獲得了即產乳酸又產雙乙醯的優良菌株。 利用啟動子庫中最強的啟動子B6，在嗜熱鏈球菌中表達了克隆自植物乳桿菌的過氧化氫酶基因，提高了嗜熱鏈球菌的存活率和貨架期，進一步證明了所建啟動子庫在優良菌株遺傳改造和代謝流向精細調控中的重要作用。
