內分生孢子

簡介

常指由真菌產生的一種形小、量大、外生的無性繁殖體。多為單細胞、色較深、不運動、抗乾燥。一般由分生孢子梗等特殊菌絲通過斷裂形成，成熟後分生。形態、構造、大小、顏色和排列等特徵因種而異，是菌種鑑定的重要依據。實踐上可用於分離、篩選、育種、保藏和接種擴大等。放線菌也有類似的分生孢子。一種無性孢子，可以為一到多個細胞的，和有許多不同的形狀（子囊菌、擔子菌、半知菌產生的無性孢子,大多由芽殖、裂殖方式產生）。

鑑定方式

內生真菌的分離培養與保存

菌株Sal54是從采自江蘇省鹽城市大豐港海灘的野生鹽生海蘆筍中分離得到。在無菌操作下, 取一根植株, 依次經過75%乙醇、1%次氯酸鈉、75%乙醇各浸泡1min, 然後用無菌水漂洗3次, 無菌吸水紙吸乾其表面水分。用滅菌後的剪刀將其剪成7~9mm小段, 放在PDA平板上, 每板3~5根, 於28℃恆溫培養至植物組織內部長出菌絲。將真菌轉移到新的平板培養基上劃線分離得到單個菌落, 然後轉移到PDA斜面試管中, 4℃保存。

真菌分離純化與發酵培養基

PDA分離培養基 (g/L) :土豆200、葡萄糖20、瓊脂20、食鹽30, 自來水配製。

液體發酵培養基 (g/L) :土豆200、麥芽糖20、甘露醇20、葡萄糖10、味素5、蛋白腖5、酵母膏3, p H6.0。

試劑與儀器

Taq酶及PCR相關試劑 (包括d NTP與PCR Buffer等) 上海天根生化科技 (北京) 有限公司;OMEGA真菌基因組試劑盒 (Fungal DNA Kit 50) 及引物 (ITS1/ITS4/NS1/NS8) 上海捷瑞生物工程有限公司;其他分析純試劑南京壽德試劑器材有限公司。

ECLIPSE TE2000-S螢光倒置顯微鏡日本Nikon株式會社;Microfuge 22R台式微量冷凍離心機美國Beckman公司;TP600型梯度PCR儀日本Ta Ka Ra公司;DYCP-31DN電泳儀北京市六一儀器廠;JS-380C全自動數碼凝膠成像分析儀上海培清科技有限公司。

菌株的耐鹽度實驗

在真菌發酵用液體培養基中分別添加30、60、90、120、150、180g/L的Na Cl, 接種後於28℃、150r/min培養7d, 觀察生長情況, 每組實驗平行3次。

菌株的形態學觀察

從保藏菌種的斜面培養基中挑取菌絲轉接到PDA平板培養基中間位置, 28℃培養4~5d, 觀察菌落大小、顏色、質地等形態特徵。挑取菌落邊緣菌絲, 製作水浸片, 在光學顯微鏡下觀察菌絲體、孢子、孢子梗等。

基因組DNA的提取

從保藏菌種的斜面培養基中挑取菌絲轉接到PDA平板上, 28℃培養4~5d。基因組DNA的提取採用真菌基因組試劑盒 (Fungal DNA Kit 50) , 嚴格按照說明書操作。提取的基因組DNA在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢測 (120V, 30min) , 溴化乙錠 (EB) 染色。4℃保存備用, 或於-20℃中長期保存。