克木毒蛋白(camphorin)是中國科學院上海生物化學研究所從樟樹種子中提取的新的核糖體失活蛋白。克木毒蛋白是Ⅰ型核糖體失活蛋白，分子量為23kD。具有三種酶活性。即RNA N-糖苷酶，依賴超螺旋構型的核酸內切酶及超氧化物歧化酶(SOD)活性。克木毒蛋白由204個胺基酸組成，與菸草Mn-SOD的同源性很高，與Cu，Zn-SOD的同源性不高，與已知順序的核糖體失活蛋白的同源性也不高。
| 中文名稱 | 克木毒蛋白 |
| 英文名稱 | camphorin |
| 定 義 | 從樟樹種子中發現的不同於辛納毒蛋白的另一種核糖體失活蛋白質。 |
| 套用學科 | 生物化學與分子生物學（一級學科），胺基酸、多肽與蛋白質（二級學科） |
基本介紹
- 中文名：克木毒蛋白
- 外文名：camphorin
- 類型：Ⅰ型核糖體失活蛋白
- 胺基酸含量：204個
- 分子量：23,000KDa
- 酶活性：3種酶活性
克木毒蛋白概述,克木毒蛋白中色氨酸及其螢光特性,
克木毒蛋白概述
核糖體失活蛋白是一類專一修飾真核或原核核糖體高分子量rRNA而抑制蛋白質合成的核毒素。到目前為止，已發現有110餘種。中國科學院上海生物化學研究所從樟樹種子中提取了兩種新的核糖體失活蛋白，並命名為克木毒蛋白(camphorin)和辛納毒蛋白(einnamomin)。我們最近研究發現克木毒蛋白具有三種酶活性。即RNAN-糖苷酶，依賴超螺旋構型的核酸內切酶及超氧化物歧化酶(SOD)活性。一種蛋白具有三種互不相關的酶活性是少見的。此外，還發現克木毒蛋白分子中只含有一個色氨酸殘基，且此色氨酸殘基與克木毒蛋白的三種酶活性有明顯不同的關係。
辛納毒蛋白和克木毒蛋白均可以抑制兔網織紅細胞裂解液及重組的大鼠肝翻譯系統的蛋白質生物合成，即辛納毒蛋白和克木毒蛋白都具有RNA N-糖苷酶活力，其作用位點皆為大鼠肝核糖體28S rRNA的4324位腺苷酸。在28S rRNA的4324位上缺失腺嘌呤鹼基的核糖體失去了蛋白質合成能力。
克木毒蛋白是Ⅰ型核糖體失活蛋白，分子量為23kD，胺基酸順序分析顯示其N端胺基酸順序與菸草Mn-SOD的N端順序有很高同源性。用鄰苯三酚自氧化法、黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶-NBT法以及聚丙烯醯胺凝膠負染法測定都證明，克木毒蛋白具有超氧化物歧化酶(SOD)活力。用cDNA法測定編碼克木毒蛋白的mRNA的順序表明，克木毒蛋白由204個胺基酸組成，與菸草Mn-SOD的同源性很高，與Cu，Zn-SOD的同源性不高，與已知順序的核糖體失活蛋白的同源性也不高。
辛納毒蛋白是Ⅱ型核糖體失活蛋白，A、B兩條鏈分別為30和33kD。辛納毒蛋白在非變性聚丙烯醯胺凝膠上會出現三條帶，這三條帶都是由類似的A、B鏈組成的。因此，我們認為辛納毒蛋白包括三種亞型(isoform)，它們的分子量相同，但等電點略有差異。胺基酸順序分析表明，三個亞型的A鏈N端胺基酸順序基本相同，與ricinA鏈的N端有較高的同源性。辛納毒蛋白B鏈與ricin B鏈的N端也有較高的同源性。我們發現，辛納毒蛋白和克木毒蛋白對人肝癌細胞7721和黑色素瘤細胞M21有明顯的抑制和殺傷效應，而對正常的小鼠上皮培養細胞(Smc-13)無抑制作用，這一結果為其臨床套用指出了可能性。根據文獻報導，目前已從9個科31種植物中分離純化出了Ⅰ型核糖體失活蛋白，在7科9種植物中分離出Ⅱ型核糖體失活蛋白。在同一種植物中同時存在兩類核糖體失活蛋白的報導很少。但在Sambucus ebulus中，同時存在三種Ⅰ型核糖體失活蛋白(ebulitinα、β、γ)和一種Ⅱ型核糖體失活蛋白(ebulin)。香樟種子中存在兩種類型的核糖體失活蛋白對研究核糖體失活蛋白的生理功能與進化很有意義。
克木毒蛋白中色氨酸及其螢光特性
用NBs修飾克木毒蛋白的研究發現，無論是在天然狀態下(在50mmol/LNaAC-HAC，pH4.0緩衝液中)還是在變性條件下(8mol/L脲中)，每個克木毒蛋白分子只有1個色氨酸殘基被NBS修飾，因此可以認為1分子克木毒蛋白只含有1個色氨酸殘基，且此殘基位於克木毒蛋白分子的表面。進一步對此色氨酸殘基的螢光研究表明，其量子產率為0.024，最大螢光發射峰在340nm，與在水溶液中的游離色氨酸的螢光峰(352nm)相比，藍移了12nm,，表明該色氨酸殘基的側鏈吲哚環並未和溶劑直接接觸，而處在一個比較疏水的環境中。
色氨酸殘基與三種酶活性間的關係
克木毒蛋白具有RNA N-糖苷酶活性。當它作用於大鼠肝80S核糖體15min後，利用苯酚/氯仿抽提總rRNA，並經酸性苯胺處理，其反應混合物經6%聚丙烯酸胺凝膠電泳鑑定，可觀察到特徵性的RNA片段(R片段)。然而，色氨酸殘基被NBS修飾後的克木毒蛋白不能產生特徵性的R片段，說明它已不能作用於大鼠肝80S核糖體中的28SRNA，即完全喪失了RNA N-糖苷酶活性，表明色氨酸殘基是RNA N-糖苷酶活性所必需的。這一結果與以前對蓖麻毒蛋白A鏈研究的結果一致。
利用1%瓊脂糖凝膠電泳可以測定克木毒蛋白對超螺旋DNA的解旋與切割活性。天然的克木毒蛋白能夠作用於超螺旋DNA(如pGM一4Z)，使之產生缺口狀DNA，甚至還可以進一步切斷DNA環，形成線狀DNA。這三種DNA在瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同，因此可以區分三種DNA，得到其相對比值，由此可計算核酸內切酶的活性。當克木毒蛋白中的色氨酸被NBS修飾後，瓊脂糖凝膠電泳結果表明，它依然能作用於超螺旋DNA，產生缺口狀DNA，酶活性和未被修飾的相仿，暗示此色氨酸殘基與此酶活性無關，但進一步酶切形成線狀DNA的活性要低於天然的克木毒蛋白，其中原因有待進一步的研究。我們根據凝膠原位負染色法使用掃描技術測定了克木毒蛋白中色氨酸殘基被修飾前後SOD活性的變化。結果表明，當色氨酸殘基被修飾後，克木毒蛋白的SOD活性損失約40%，暗示色氨酸殘基雖不是其SOD活力所必需，但對其活性有很大影響。克木毒蛋白中唯一的色氨酸殘基與其三種酶活性有上述如此不同的關係，暗示這三種酶活性中心可能在蛋白質分子中占據不同的部位。
