《他克莫司菌株動態代謝調控模型指導下途徑改造》是依託天津大學，由聞建平擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：他克莫司菌株動態代謝調控模型指導下途徑改造
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：聞建平
- 依託單位：天津大學
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
本研究針對他克莫司的生物合成調控行為，通過實驗建立他克莫司菌株生物合成的以碳代謝和基因簇代謝調控元件為主，輔助氮代謝、磷代謝、硫代謝的調控元件和結構元件，並進行表征、調控模組設計與集成、調控模組系統組裝與調試，獲得系列代謝和調控功能明確的標準化元件；基於系統生物學方法，從動態、代謝、調控角度出發，構建他克莫司基因組尺度動態代謝調控網路模型，利用動態通量平衡分析結合組學方法確定調控因子對他克莫司合成途徑的定量關係，模擬他克莫司合成的限速步驟、關鍵節點和關鍵途徑，確定目標基因操作靶點；結合基因敲除和擴增編碼和調控基因等分子手段加強流經限速步驟的通量，從深層次角度確定他克莫司合成途徑中催化目標酶/酶系的結構和功能作用機制，結合定點突變實驗技術，最佳化目標酶/酶系基因功能域結構，獲得性質優良的目標酶/酶系並轉接到他克莫司生物合成基因簇中，最終實現整個基因簇的最佳化表達以及他克莫司的高效最佳化合成。
結題摘要
本研究首先採用代謝組學、蛋白組學和轉錄組學等系統生物學方法，從實驗角度對他克莫司發酵過程中菌體胞內的碳代謝、氮代謝、磷代謝和硫代謝等代謝途徑及其相應的代謝調控元件與潛在作用機制進行了解析，採用WGCNA法發現磷酸戊糖途徑、莽草酸途徑和天冬氨酸途徑與他克莫司的高效合成呈顯著正相關性，且上述三條途徑極可能為限制他克莫司高效合成的關鍵限速途徑，進一步採用MALDI-TOF/TOF-MS法在外加豆油條件下鑑定了77個差異蛋白點，以及聯合代謝組學和轉錄組學技術在不同化學觸發劑及其組合處理下識別出PKS和SigE和AraC家族調控因子等多個顯著差異表達基因可能為FK506合成過程中潛在的胞內代謝調控靶點，並解析了胞內代謝的動態回響機制。在此基礎上，通過精確設計動態模型框架、動態約束和常微分方程等模組條件，成功構建了筑波鏈黴菌基因組尺度動態代謝網路模型，進一步採用動態通量平衡分析算法對動態模型進行了參數敏感性和模擬預測準確性等模擬分析。隨後，通過動態通量平衡分析和最小代謝調節分析耦合算法進一步對他克莫司合成的限速步驟、關鍵節點和關鍵途徑進行了模擬預測，並成功識別出52個敲除靶點和29個過表達靶點。依據所有預測靶點的fPH值排序結果，分別選取gcdh、tktB、ask和msdh四個靶基因分別進行了單基因和多基因組合後的基因工程改造，構建的所有的工程菌株均能夠有效提升FK506發酵產量，其最高產量可達126.61mg/L，較出發菌株提高了2.29倍。進一步對上述關鍵基因對應的酶促反應涉及的代謝途徑進行分析發現，通過對上述目標酶進行改造後，可有效減少他克莫司的副產物子囊黴素的乙基丙二醯輔酶A前體合成途徑通量，和提升他克莫司合成前體途徑中的派克酸合成途徑、磷酸戊糖途徑以及甲基丙二醯CoA合成途徑的代謝通量，進一步結合外源添加相關前體和化學觸發劑，他克莫司產量最終可達303.6mg/L。
