人源iPSC的肝細胞分化及其三維體系中代謝功能研究

《人源iPSC的肝細胞分化及其三維體系中代謝功能研究》是依託江蘇大學，由余江南擔任項目負責人的面上項目。

基本介紹

• 中文名：人源iPSC的肝細胞分化及其三維體系中代謝功能研究
• 項目類別：面上項目
• 項目負責人：餘江南
• 依託單位：江蘇大學

項目摘要

肝細胞模型已成為藥物代謝研究中套用最廣泛的模型之一。本項目將人源多能幹細胞誘導分化為肝樣細胞後種植於三維支架中，構建人源化肝細胞的三維培養模式，以期克服現有肝細胞代謝模型的不足：人的肝細胞來源困難、體外活性維持時間短。內容包括：非病毒納米粒介導的人源誘導多能幹細胞研究、人源iPSC向肝細胞的定向誘導分化、二維培養藥物代謝酶表達及細胞活性研究、三維培養藥物代謝酶表達及活性持續時間研究、中藥活性成分在人源化肝細胞中的代謝研究。通過評價肝細胞功能和代謝活性、檢測藥物代謝酶的表達變化，比較源自iPSC的肝細胞和正常肝細胞的異同，同時考察三維培養體系中肝細胞活性的維持時間。研究中藥活性成分在新模型中的代謝及對誘導肝細胞的損傷及藥物代謝酶的調控作用，分析其可能的代謝產物。本項目旨在構建人源肝細胞三維代謝新模型，從而為藥物代謝研究提供新思路、新技術。

結題摘要

本課題重點圍繞人源多能幹細胞誘導分化為肝樣細胞，而後種植於三維支架中，構建人源化肝細胞三維培養模式開展研究，內容包括：1、製備、表征磷酸鈣-OSKM非病毒納米粒，並進行人源誘導多能幹細胞（iPSCs）研究，成功獲得胚胎幹細胞樣、陽性表達鹼性磷酸酶和各種多能幹細胞標記物（包括OCT4, KLF4, NANOG, TRA-81）的人源iPSCs；2、人源iPSCs向肝細胞定向誘導分化。運用免疫螢光染色和ELISA法檢測肝細胞特異性蛋白表達水平，結果表明：人源iPSCs誘導的肝細胞陽性表達特異性蛋白ALB、AFP、CK18，對天然產物槓柳苷元在大鼠肝微粒體中的代謝進行初步研究，為後續人源化肝細胞代謝研究奠定基礎；3、二維培養體系中人源肝細胞藥物代謝酶表達及細胞活性研究。顯微鏡觀察人源誘導肝細胞呈雙核或多核形態；Western blot測得人源誘導肝細胞藥物代謝酶（CYP450和GST）的表達與正常肝細胞相當；試劑盒測得人源誘導肝細胞中各種酶（谷丙轉氨酶、穀草轉氨酶、乳酸脫氫酶）的表達、白蛋白水平、尿素質量濃度以及消耗葡萄糖量均與人正常肝細胞趨於一致，說明人源誘導肝細胞具有類似於人正常肝細胞的功能；4、製備並最佳化組織工程三維支架，考察三維培養體系中人源肝細胞藥物代謝酶表達及活性持續時間。與二維體系相比，三維體系利於人源肝細胞的生長和增殖，HE染色和免疫組化染色結果表明：人源誘導肝細胞在三維體系中形成雙核或多核細胞的肝樣組織，陽性表達肝細胞極化蛋白BSEP，藥物代謝酶的表達和活性均有明顯增加，與人正常肝細胞基本一致，並具有與人正常肝細胞相當的藥物代謝活性；5、對中藥活性成分在人源化肝細胞中的代謝進行研究。與二維體系相比，三維體系中藥物對肝細胞的毒性明顯減小；採用RT-PCR、Western blot、LC-MASS等考察西利賓胺、黃芩苷等對藥物代謝酶表達的調控和代謝活性的影響，結果表明：西利賓胺將誘導人源肝細胞代謝後產生了兩個明顯的代謝物峰，通過LC-MASS和查證文獻，其中分子量為657.1474 Da的代謝峰結構確證為水飛薊賓糖醛酸化產物（silybin B-7-O-β-glucuronide），分子量為655.1474 Da的代謝峰是首次發現的水飛薊賓代謝產物，推測為水飛薊賓母核糖醛酸化物。本項目成功構建了人源肝細胞三維代謝新模型，為藥物代謝研究提供了新思路、新技術。