二次諧波

諧波產生的根本原因是由於非線性負載所致。當電流流經負載時，與所加的電壓不呈線性關係，就形成非正弦電流，從而產生諧波。諧波頻率是基波頻率的整倍數，根據法國數學家傅立葉(M．Fourier)分析原理證明，任何重複的波形都可以分解為含有基波頻率和一系列為基波倍數的諧波的正弦波分量。諧波是正弦波，每個諧波都具有不同的頻率，幅度與相角。諧波可以I區分為偶次與奇次性，第3、5、7次編號的為奇次諧波，而2、 4、6、8等為偶次諧波，如基波為50Hz時，二次諧波為100Hz，三次諧波則是150Hz。

基本介紹

• 中文名：二次諧波
• 外文名：Two harmonics
• 根本原因：由於非線性負載所致
• 特點：與所加的電壓不呈線性關係
• 所屬領域：電力術語

二次諧波顯微成像技術

微觀世界的很多有用信息可以通過採用顯微技術獲得，顯微成像技術在生命科學、醫學、工業測量等不同領域有著巨大的研究價值和廣泛的套用，因此，顯微成像技術一直是人們研究的熱點。非光學顯微術，如電子顯微技術、掃描隧道顯微技術等，存在對觀察樣品環境要求嚴格、對觀察對象造成傷害、對觀察樣品限制較多等弱點，而光學顯微術沒有這些弱點缺陷，因此，光學顯微術的發展完善和功能拓展具有重要意義。近年來，計算機技術、雷射技術和精密機械電子等技術得到飛速發展，隨著這些技術的提高，出現了雷射共焦掃描顯微成像技術、雙光子雷射掃描共聚焦顯微成像技術、光學相干層析成像等很多種不同功能和特性的現代光學顯微術。二次諧波顯微成像技術是其中的一種現代非線性光學顯微術，它利用光與物質相互作用時產生的二次諧波信號進行顯微成像或探測。

二次諧波顯微成像原理

在非線性光學過程中，在強雷射作用下的非線性介質，其電極化強度與激發光場的關係可以表示為 ：

公式（1）

量公式（1）說明極化強度是由激發光場和介質相互作用而產生的，它不僅與入射到介質中的激發光場的光場強度有關，還與介質的極化率有關。在非線性光學中，這些線性和非線性極化率與介質的微觀特性有關，代表了介質的光學性質，反映了介質的電子態、分子的對稱性、旋向及排列等，因此介質的微觀結構信息可以通過探測介質非線性光學現象來獲得。二次諧波產生過程是和頻過程的一種特殊情況，即倍頻。倍頻效應是指兩個頻率相同的入射光發生和頻作用，其輸出光波的頻率為入射光場頻率的二倍，其中入射光波稱為基頻，輸出倍頻光波稱為二次諧波。相應的極化強度為：

公式2

二次諧波產生需要滿足兩個條件：一是要求介質要具有非中心對稱性。在電偶極子近似下，具有中心對稱性的介質，其二階電極化率張量為零，則不能產生二次諧波信號。二是要求滿足相位匹配條件。相位匹配直接決定一個非線性光學過程的效率。如果二次諧波產生過程中完全滿足相位匹配條件，則傳播中的倍頻光波和不斷產生的倍頻極化波之間保持相位的一致性，相互干涉，產生的二次諧波強度由零開始逐漸增大，直至基頻波的功率完全轉為二次諧波的功率，獲得最大的二次諧波輸出功率。

二次諧波顯微成像裝置由四個部分組成：第一部分是光源，通常需要提供功率適中的激發光，既可以保證產生較強的二次諧波信號，也可以避免樣品受損。在二次諧波顯微技術中光源通常採用可在整個紅外區內可調諧的摻鈦藍寶石飛秒雷射器。第二部分是物鏡，可以減小激發光的激發區域，並收集樣品產生的非軸向輻射的二次諧波信號，避免能量損失。通常採用數值孔徑足夠大的物鏡。第三部分是濾光片組，可保證收集到的信號為二次諧波信號，過濾干擾信號。在前向探測模式中，通常採用短通濾光片和窄帶濾光片，在背向探測模式中，通常採用窄帶濾光片。第四部分為信號探測系統，可以進行二次諧波信號的收集探測。通常採用高靈敏度的PM T探測器，或與激發光源同步的信噪比高的鎖相放大器。

二次諧波顯微成像技術特點

不同於其他的現代光學顯微成像技術，二次諧波顯微成像技術由於利於樣品的非線性特性產生的二次諧波信號進行成像和探測，因此，具有以下主要特點：

①傳統的雷射共焦顯微鏡採用共焦小孔成像，二次諧波顯微成像產生的信號光由於非線性效應的強局域特性被局限在焦點附近很小的區域裡，在成像過程中非焦點區域發光對測量結果的影響大大減小，因此，它不採用共焦小孔就可以實現高解析度成像，還具有較高的信噪比，具有較高的三維空間解析度，並且可以對具有一定厚度的樣品進行層析成像。

②在二次諧波顯微成像技術中，通常激發光源採用近紅外的飛秒雷射器，這樣減小了對生物樣品的光損傷，降低了光漂泊，增加了樣品的穿透深度。

③二次諧波信號是樣品的原發性信號，成像過程不需要使用染料進行染色，這樣避免了光化學毒性及染色過程中的物理損傷，沒有染色過程也使該技術可用於很多被測樣品不能進行螢光標記的成像探測。

④利用二次諧波信號進行成像或探測時，二次諧波信號的相干性使其對樣品局部微觀結構具有較高的敏感性，因此探測到的二次諧波信號不僅能反映與樣品有關的強度信息，還可以反映樣品的分子取向、排列方式等局部微觀結構，這些重要而本質的信息可以通過分析信號的角度分布或偏振特性等得到。

⑤二次諧波顯微鏡雖未商品化，但雙光子螢光顯微系統已經商品化，二次諧波成像顯微鏡可以很容易地在其基礎上經過簡單改造獲得，如通過更換濾光片改造而成，耗費較小。

⑥二次諧波成像顯微鏡可以收集背向信號，可以和其他的成像技術進行同時探測，如雙光子螢光顯微鏡、光學相干層析成像，實現多通道顯微成像或探測，更加有利於進行成像結果對比研究，實現信號互補。

二次諧波顯微成像技術的套用

在生命科學領域，二次諧波顯微成像技術由於其無光損傷、無光毒性、無光漂白等特點，在生物組織成像中有廣泛的套用。研究表明，一些結構蛋白如膠原蛋白、肌動球蛋白複合、微管蛋白等，都具有很強的二次諧波信號，不同的膠原蛋白類型在同等激發條件下，呈現不同的二次諧波信號強度，因此二次諧波顯微成像技術可以用於生物組織的結構蛋白成像。生物細胞和組織成像也可以通過二次諧波顯微成像技術實現，Shi-W eiChu等人曾用此技術觀察到了斑馬魚體內細胞分芽繁殖、原腸胚的形成、組織的形成等晶胚發育過程 。Andrew等人用苯乙烯基染劑產生二次諧波 信 號 ，研 究 發 現 其 對 膜 電 壓 的 敏 感 度 達 到40/100m V。二次諧波成像可以實現膜之間分離距離的測量，測量的精度比其他顯微鏡都高。不僅如此，根據二次諧波信號對分子分布的對稱性的依賴，可以實時觀察膜上分子的動力學變化規律，這比通常使用的核磁共振更加方便快捷。因此二次諧波顯微技術在膜成像和動態測量中有重要的套用 。另外，二次諧波顯微成像可以對基因組DNA溶液、細胞核提取物、培養細胞的細胞核等不同DNA樣品進行檢測，獲取DNA樣品的二次諧波信號並進行高解析度成像 。

在醫學研究領域，二次諧波顯微成像技術在腫瘤、皮膚科、牙科等研究方向都有廣泛的套用。二次諧波顯微成像技術能探測到子宮頸、口腔、食道、耳朵、鼻子等處的黏膜組織的病變，為腫瘤的診斷和分析提供了一份很好的參考，在癌症的早期診斷中能起到一定的作用。另外，通過二次諧波顯微成像可以實現藥物通透性的活體監控。二次諧波顯微成像技術可以實現牙齒的成像，為牙科提供了一種新的光學診斷方法。此外，該技術還可以在不損傷角膜的情況下觀察到角膜的結構，以及實現對眼底視網膜的成像研究。

在材料科學領域，二次諧波顯微成像技術在納米材料方向中也有廣泛的套用。二次諧波顯微成像技術可以對單個有機納米晶體的取向進行探測，從而判斷納米晶體的晶體類型，也可以通過分析二次諧波信號的偏振特性來分析氧化鋅薄膜的結晶品質和晶體生長取向，還可以通過偏振分析和離焦成像的方法獲得單個KTP納米粒子的三維取向信息和晶軸的歐拉角 。對於中心對稱材料，其表面由於對稱性遭到破壞而可以產生表面二次諧波信號，不僅能反映各向同性媒質屬性，還可以反映長程有序材料的晶體結構。

二次諧波成像技術在生物組織的套用進展

二次諧波成像

二次諧波（SHG）是二階非線性過程，它是基於雙光子激發螢光顯微鏡之上； 雙光子激發螢光顯微鏡不需要共焦針孔就可以實現三維高解析度，並且其激發的雷射在組織中的穿透深度大，因此成像深度比較大。針對生物組織，二次諧波信號成像還具有如下特點，如：

①二次諧波是生物組織原發性信號，從而光致毒性、光損傷和光漂

白這些致缺點對其而言就不復存在了。

②SHG 是相干散射過程，所成的像能反映出樣品內部的細微結構。

③二次諧波的光譜寬度完全由激發光源決定，此點很重要，因為各

種信號干擾就會被有效消除了，從而獲得較高的圖像解析度。

④在無外加染料的情況下，生物組織的成像依舊完好。

SHG 成像在生物組織的套用現狀

Denk 與 Webb 等人於 1990 年首次展示雙光子激發螢光顯微成像，之後雙光子顯微鏡 (Two-photon Microscopy) 在生物醫學領域得到廣泛套用，是研究光與組織間的物理和生物效應、細胞之間的相互作用、細胞內生化成分和離子濃度的變化等的有力工具。

1998年，Peter T. C. So 及其研究成員 對穿孔的鼠耳進行雙光子深度分辨成像，並進行 3D 圖像重構，獲得了的皮膚結構符合組織病理學已有的結論，即角質細胞在上皮層，膠原和彈力纖維在真皮層，軟骨在皮下的皮膚結構。

2001年，Fernando A. Navarro 研究小組 利用雙光子共聚焦顯微鏡觀察幾內亞小豬皮膚創傷修復情況，並與傳統的使用蘇木精和伊紅染色劑的二維顯微圖像比較發現，雙光子共聚焦顯微鏡能夠得到三維重構圖像。 實驗還使用化學試劑或膠帶剝離角質層後進行觀察，發現雙光子共聚焦顯微鏡圖像能達到更深的基細胞層， 真皮與上皮交界層，清楚地分辨角質細胞，基細胞和膠原纖維。 對傷口修復的研究表明，創傷時角質層通常是不存在的，因此移除是沒有必要的。

2002年，Steven R. Beanes 等人 運用共聚焦顯微鏡觀測不同孕育期的胎鼠創傷，實驗發現：胎鼠傷口在孕育期從無疤痕到有疤痕修復的轉變主要受創傷的大小和胎兒孕育時間的影響。 該實驗小組早期主要是利用組織液培育切割的離體的母鼠創傷模型。 該模型在仿真傷口修復中有明顯的缺陷，即不能完整修復真皮缺損，僅僅是表皮再生，部分真皮修復發生。 而且血液產生的因子，比如細胞活素，激素，血小板對傷口修復的影響將無法分析。 至此，沒有離體皮膚傷口修復的模型能完整模擬真皮的修復。

2005年，R.Cicchi 等人 研究發現利用光透明劑對組織的不同成分的影響程度不同和光透明劑滲透進組織後會導致組織的局部脫水，就可以增強光在組織中不同成分間分布的差別，從而提高二次諧波成像的成像對比度。 得出了光透明劑在提高生物組織雙光子螢光顯微成像深度的同時也提高了成像對比度的研究結論。

2007年，Iris Riemann 等人 [6] 通過基於飛秒雷射近紅外脈衝的多光子層析成象系統 DermaInspect 觀察除痣後人體真皮創傷的癒合和疤痕的形成。 通過內源螢光團的自體螢光和膠原的二次諧波 (SHG) 能觀測修復過程中主要膠原纖維的聚合。 實驗發現修復過程中深層的乳頭狀層和基層似乎向上移動， 14 — 15 天乳頭狀層中的出現纖維， 28~35 天纖維量達到最大。 同時還發現垂直傷口閉合方向出現大量膠原纖維結構。 實驗表明 DermaInspect 系統能夠觀察創傷癒合不同時期細胞組織結構的自體螢光和膠原纖維沉積，將成為皮膚科醫生診斷和檢測治療效果有利的工具。

2008年，Jason N.Rogart 等利用多光子顯微鏡來決定激發胃腸黏膜的最佳激發波長，得到用 735nm 激發，能夠出現多光子自體螢光強度峰值；而且與共聚焦顯微相比，多光子顯微檢測得到的細胞內的微細結構更加清晰，像上皮細胞核、杯狀細胞、異色纖維和細胞等結構的解析度相當於標準的 H&E 染色組織學結構。該研究顯示，多光子顯微鏡可以在細胞水平上檢測腸胃黏膜組織， 且不需要任何螢光染料，為活檢技術提供大量實用的參考依據。

2010年，Hongchun Bao 等人 利用緊式顯微內鏡，獲取體內的二次詣波成像，從而達到實時監控體現膠原的含量和結構的目的。 膠原變化對於不同疾病的早期診斷具有很重要的意義。 本研究首次通過光纖維將非線性顯微內鏡套用於二次詣波成像。 高分辨的二次詣波成像可揭示出蛋白和膠原的結構，並確定結構的方向和維度。

2011年，Naoyuki Morishige 等人 通過二次諧波獲得膠原片層的三維結構，而人眼角膜前基質的膠原片層的結構是角膜硬度的決定因素，此對眼疾的診斷和治療有著重要的意義。

存在的問題及展望

基於二次諧波信號成像的非線性光學成像技術 , 能夠為生物組織的早期無損診斷提供有效的方法 , 然而由於組織的渾濁特性使其對可見光和近紅外波長具有很強的散射效應 , 導致基於雷射的治療和診斷技術受到很大限制。 使用光透明劑 ( 甘油等 ) 提高組織內部的折射率匹配從而降低散射效應的方法能夠非常有效地提高生物組織二次諧波成像深度和對比度 , 有望在生物醫學領域得到廣泛套用。