二化螟中腸Cry1A毒素功能受體的鑑定

《二化螟中腸Cry1A毒素功能受體的鑑定》是武淑文為項目負責人，南京農業大學為依託單位的青年科學基金項目。

基本介紹

• 中文名：二化螟中腸Cry1A毒素功能受體的鑑定
• 項目類別 ：青年科學基金項目
• 項目負責人：武淑文

結題摘要

在二化螟中腸上存在多種Cry1Ac毒素的結合蛋白，但導致Cry1Ac產生毒殺作用的功能受體仍不明確。確定二化螟體內Cry1Ac毒素的功能受體對於闡明Bt毒素的作用機制具有重要意義。本項目利用Pull-down技術在非變性條件下捕獲了二化螟中腸Cry1Ac毒素的結合蛋白。利用LC-MS/MS方法對結合蛋白樣品進行了分離鑑定。結果表明這些蛋白可分為三類：第一類是已確認的其它昆蟲體內Cry1Ac毒素的功能受體，包括鈣粘蛋白及氨肽酶系（APN1、APN3和APN4）。第二類是已報導的昆蟲體內Cry1Ac毒素的結合蛋白，包括V-ATP酶亞基和熱激蛋白。第三類是大量與代謝、細胞信號調控相關的蛋白，這些蛋白與Cry1Ac的結合性以及是否參與毒殺作用尚未見報導。本項目利用RNA干擾技術（菌液餵飼法）對結合蛋白中的氨肽酶系、鈣粘蛋白是否為Cry1Ac毒素的受體進行了功能驗證。在連續取食含有dscad、 dsapn1、dsapn3或dsapn4的菌液後，二化螟幼蟲體內相應基因的表達量分別降低了40%、30%、41%及36%。但在Cry1Ac活化毒素處理濃度為0.8 µg/100 µl時，只有取食了dscad、dsapn4的幼蟲的死亡率降低到66.5%和65.6%，明顯低於對照幼蟲和餵食dsgfp的幼蟲，且差異達到極顯著水平。結果表明經RNA干擾後，鈣粘蛋白和APN4在二化螟體內的表達量降低，從而有效減少了與Cry1Ac活化毒素的結合量並造成二化螟幼蟲對毒素的敏感性下降。由此說明鈣粘蛋白和APN4可能做為功能受體參與了Cry1Ac毒素對二化螟的毒殺作用。

項目摘要

我國自主研發的轉Bt抗蟲水稻已於2010年取得轉基因生物安全證書，即將進入商業化種植階段。轉Bt抗蟲水稻表達的外源殺蟲蛋白主要是Cry1A毒素，二化螟是其重要的靶標害蟲。配基結合試驗表明，二化螟中腸BBMV中存在多個Cry1A毒素結合蛋白，但導致Cry1A產生毒殺作用的功能受體仍不明確。本項目採用Pull-down技術和交聯/標記轉移技術，擴大結合蛋白的誘集範圍，篩選捕獲二體螟中腸BBMV上Cry1A毒素的功能受體。然後，利用昆蟲細胞系進行異源表達，從親合力、結合性及細胞毒性等方面對其進行驗證，並通過RNA干擾技術研究受體蛋白的生理功能。本研究結果既可揭示Bt毒素對二化螟的作用方式，同時又為二化螟Bt抗性分子機理的研究奠定基礎，為二化螟Bt抗性的田間監測及抗性治理提供理論依據。