乾血紙片法

乾血紙片法

乾血紙片法(dried blood spot,DBS),即將全血樣品收集在卡紙上,在血樣採集方法上比傳統方法有一定的優勢。它需求較少的血量,可減少動物使用,方便血樣採集、存儲運輸,是罕見疾病篩查過程中的一項有效工具。乾血紙片法早在上世紀六十年代就已被用於苯丙酮尿症新生兒篩查中。隨著串聯質譜技術等的發展,乾血紙片法在遺傳代謝類疾病的診斷及篩查中的套用價值日漸突顯。

基本介紹

  • 中文名:乾血紙片法
  • 外文名:driedblood spot
  • 所屬分類:檢查項目
原理,套用範圍,優勢和局限性,優勢,局限性,套用流程,

原理

乾血紙片法的原理是將全血滴加在濾紙片上,乾燥後得到乾血斑塊,經溶劑萃取後,通過螢光反應法、串聯質譜法等分析乾血斑中待檢測組分的信息來反映患者的診斷結果,如病毒DNA含量、代謝產物含量、酶活性等。

套用範圍

截至2015年5月乾血紙片法主要套用於代謝相關疾病的篩查、藥物動力學研究以及新生兒篩查等。對於遺傳代謝性疾病,代謝酶代謝產物能夠較為穩定存在於乾血紙片中,因而在對代謝異常類疾病樣本進行篩查分析時,乾血紙片法能較為準確的反映樣本中代謝酶或代謝產物的含量。

優勢和局限性

臨床套用中的優勢和局限性

優勢

從樣本保存的角度上來說,乾血斑比全血更為穩定,所以其儲存及運輸成本遠低於全血。另外,乾血紙片需要採集的樣本量較少,因此乾血紙片在需要多次採樣來進行診斷的檢測中有著特定的優勢。
由於乾血紙片法的簡易性和較高的穩定性,在許多大規模疾病篩查中(如新生兒的遺傳病篩查)已經顯現出來了極為廣泛的套用前景。國外已經廣泛將乾血紙片套用於疾病篩查樣本運輸中,在一定程度上替代了傳統的全血的運輸方式。國內也逐漸開始使用乾血紙片進行血液製品的運輸,多家醫院已經使用乾血紙片運輸血樣進行愛滋病(HIV)、C型肝炎糖原貯積病龐貝病等疾病篩查。

局限性

值得注意的是,乾血紙片在臨床上的套用仍然存在一定的局限性。對於包括戈謝病在內的遺傳代謝性疾病,乾血紙片僅能作為高危篩查或者新生兒大規模篩查的手段,確診仍需要進一步對全血進行酶活性檢測(酶學檢測是診斷的金標準),並結合基因突變檢測完成疾病的診斷。

套用流程

在戈謝病診斷及篩查中的套用
戈謝病概況
溶酶體貯積病(Lysosomal Storage Disorders, LSDs)是一類遺傳性代謝性疾病,由於基因突變導致溶酶體內的水解酶異常或者缺失,引起溶酶體功能缺陷,致使溶酶體通路內的代謝物在組織器官貯積。由於大多數的LSDs都是由於溶酶體內酶缺失或者功能異常導致,所以LSDs的主要診斷方式就是檢測血液中酶的活性。
戈謝病(Gaucher Disease, GD),溶酶體貯積病中最常見的一種疾病,是一種由於酸性β-葡萄糖苷酶(Acid β-Glucocerebrosidase, GBA)基因突變引起的常染色體隱性遺傳病。由於基因突變,造成體內該酶活性下降,從而導致其底物葡萄糖脂不能被正常降解而在溶酶體中貯積,在多種組織中形成典型的溶酶體貯積細胞即戈謝細胞,導致受累組織器官出現病變,出現脾腫大、血小板減少症等症狀。大量研究已經發現酶替代療法可治療戈謝病。因此及早診斷是治療這一疾病的關鍵。
乾血紙片法結合螢光反應法、數字微流控酶活力檢測(Digital Microfluidic Enzyme Assay)、液相色譜-質譜聯用(LC-MS/MS)等檢測GBA活性是最常用於戈謝病篩查的方法。當前僅有北京協和醫院上海新華醫院廣州市婦女兒童醫療中心華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院可進行戈謝病的確診。因此乾血紙片法的簡易性和穩定性能為偏遠地區的戈謝病患者更快得到確診提供方便。
乾血紙片法的採樣、萃取流程
(1)在收集卡中填寫病人的姓名和採集日期等信息。由於戈謝病診斷需要檢測酶活力,故常採用具有蛋白保存功能的濾紙片進行樣本採集,如Whatman 903濾紙片;
乾血紙片法
乾血紙片法樣本採集卡樣式
(2)採血取樣。可使用毛細血管和靜脈血(可以使用EDTA或ACD抗凝劑,但應避免使用肝素),注意不要使用含碘的消毒劑,在DBS卡的每個圈中滴一滴血,確保覆蓋整個圈切完全滲透該濾紙(血滴僅滴在濾紙的一面,不要在同一濾紙圓圈中重複滴上血液)。
(3)為了保留酶的活性,首先必須在室溫下乾燥4小時。乾燥時保持濾紙懸空,水平固定在桌面邊緣,以保證充分乾燥,注意使卡片遠離直接的熱源或日光。為了避免交叉污染,一旦採集血樣後,勿將卡片重疊放置。在血斑完全乾燥後,使用塑封帶將乾燥收集卡進行封裝,注意不要用手接觸血斑,以防樣本被污染。樣本一般為室溫保存及運輸,如需長期儲存,需深低溫(-70度)保存。
(4)用打孔器在樣品區截取一個小圓片,加入溶劑進行洗脫。在打孔器打孔過程中,要嚴格按照卡紙圓圈進行打孔,防止在打孔過程中樣本間相互污染而影響檢測結果。洗脫獲得的樣本可用於後續的儀器檢測。
基於以上操作原理和方法,國內外已經開發了一批自動化的乾血紙片法採樣系統。通過自動化設備可實現多樣本同時採集和萃取分析。

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