公告信息
農業部
公告第2078號
根據《獸藥管理條例》和《獸藥註冊辦法》規定,我部組織制定了口蹄疫滅活疫苗內毒素和總蛋白測定法,現予發布,自發布之日起執行。
特此公告。
檔案內容
口蹄疫滅活疫苗內毒素測定法
吸取12 ml疫苗放入15 ml離心管中,置50±5℃水浴90分鐘,然後在4℃條件下,以15000 g離心10分鐘,取水相5.0 ml,按現行《中國獸藥典》一部附錄進行檢驗。每頭份疫苗中內毒素含量應不高於50 EU。
口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法
取1瓶疫苗恢復至室溫,在3個1.5ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,充分混勻,室溫放置10分鐘,在4℃條件下,以15000g離心15分鐘。吸棄液相,沉澱物用400μl丙酮洗滌2次,室溫乾燥約15分鐘,加50μl去離子水復溶後,按附註進行檢驗。每毫升疫苗總蛋白含量應不高於500μg。
附註:口蹄疫滅活疫苗總蛋白測定法
1.方法與原理
本法適用於口蹄疫病毒油佐劑滅活疫苗總蛋白含量檢測。本法系福林酚法(lowry法),依據蛋白質分子中含有的肽鍵在鹼性溶液中與Cμ2+螯合形成蛋白質-銅複合物,此複合物使酚試劑的磷鉬酸還原,產生藍色化合物,同時在鹼性條件下酚試劑易被蛋白質中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸還原呈藍色反應。在一定範圍內其顏色深淺與蛋白質濃度呈正比,以蛋白質對照品溶液作標準曲線,採用比色法測定供試品中蛋白質的含量。
2.試劑與儀器
2.1試劑丙酮(分析純)、無菌去離子水、商品化Lowry法改良試劑盒;
2.2設備酶標儀(全波長),“Μ”型96孔板,卡介苗注射器,單通道和多通道移液器,渦旋震盪儀,酶標板振盪器等。
3.操作步驟
3.1標準系列稀釋液製備將商品化試劑盒內標準牛血清白蛋白(2mg/ml母液),按下表依次稀釋。
3.2檢驗疫苗處理取1瓶疫苗恢復至室溫搖勻後,在3個1.5 ml離心管中分別精確加入100μl疫苗和900μl丙酮,充分混勻,室溫放置10分鐘,在4℃條件下,以15000 g離心15分鐘。吸棄液相,沉澱物用400μl丙酮洗滌2次,室溫乾燥約15分鐘,加50μl去離子水復溶備用。
3.3反應板加樣與讀數
3.3.1各取3.1稀釋的各濃度牛血清白蛋白標準溶液40μl,以及三重複待檢疫苗樣品40μl,分別加入到96孔板內。用排槍迅速加入200μl改良lowry法試劑盒內試劑,立即用振盪器混勻30秒;
3.3.2封膜,室溫孵育10分鐘;
3.3.3各孔內分別加入20μl 1倍酚試劑(試劑盒內為2倍,用前用去離子水現稀釋),立即用振盪器混勻30秒;
3.3.4封膜,室溫孵育30分鐘;
3.3.5酶標儀測定750nm吸光值,保存讀數。
3.4數據處理
根據系列標準蛋白稀釋液的濃度(0μg/ml~2000μg/ml)和750nm吸光值,使用EXCEL以吸光值為X軸,以蛋白標準濃度為Y軸,繪製標準曲線,依據趨勢線求得多項式,其多項式R2≥0.98。
將被檢樣品的吸光值代入標準蛋白獲得的多項式,計算樣品中蛋白含量,根據取樣量求得1ml樣品中蛋白含量。例如口蹄疫滅活疫苗水相/油相比例為1:1,免疫劑量為2ml時,100μl疫苗經丙酮沉澱後用50μl去離子水復溶,測得濃度即為每頭份疫苗中蛋白濃度,或2ml疫苗中蛋白濃度。結果判定時,將測定值除以2即得每毫升疫苗中總蛋白含量。
3.5結果判定
若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量小於或等於500μg,則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規定;若測定結果為每毫升疫苗總蛋白含量大於500μg,判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規定。
3.6檢測數據處理舉例
3.6.1收集數據如表所示
上述表格中,A1-A9為系列稀釋的標準牛血清白蛋白溶液,A1至A9蛋白濃度依次增高;B、C、D行中1-6列為檢測樣品750nm吸光值,B1-B6為6批不同批次疫苗樣品,每一列為同一疫苗樣品三個重複。
3.6.2繪製標準曲線:將上表中數據複製到EXCELL表格中,
採用EXCEL程式,選中1-9列對應的兩行數據→“插入”→“散點圖”,選擇“帶平滑線和數據標記的散點圖”,得到以750nm吸光值為X軸,以蛋白濃度為Y軸的曲線圖。選擇“圖表工具”中“布局”→ “趨勢線”→“其他趨勢線選項”,選中“多項式”、“顯示公式”和“顯示R平方值”。通常R平方值大於等於0.98表明標準曲線可信。每一塊96孔板應設一組標準並繪製相應標準曲線。
3.6.3數值計算
以樣品測定OD750值為X,代入y = 411.69x2+ 220.65x - 3.9423,Y為蛋白濃度,以表中第一批疫苗測定結果為例。該疫苗三重複測定的OD750數據(X)分別為:0.677、0.640、0.641,代入公式計算蛋白含量(Y)分別為:334μg/ml、306μg/ml、307μg/ml,該數據為每毫升水相抗原中總蛋白含量。計算三重複數值的平均值(AVERAGE)為316μg/ml,標準差(STDEV.P)為13.1,變異係數為4.15%(標準差/平均值*100%),將每毫升水相抗原中總蛋白含量,除以2折算為每毫升疫苗總蛋白含量,該疫苗的總蛋白含量為138μg/ml。按照上述方法,可計算其他樣品的總蛋白含量。
3.6.4結果判定
同一樣品不同重複間變異係數應小於5.3%,否則試驗不成立,應重做。若測定值小於或等於500μg/ml,則判定被檢疫苗總蛋白含量符合規定;若測定值大於500μg/ml,則判定被檢疫苗總蛋白含量不符合規定。