《不同DYNC1H1突變體在運動與感覺神經元選擇性變性中的作用》是依託復旦大學，由陳向軍擔任項目負責人的面上項目。
基本介紹
- 中文名：不同DYNC1H1突變體在運動與感覺神經元選擇性變性中的作用
- 依託單位：復旦大學
- 項目類別：面上項目
- 項目負責人：陳向軍
項目摘要,結題摘要,
項目摘要
運動與感覺神經元變性存在選擇性，但其分子機制尚不明確。近年研究表明，編碼逆行性軸索運輸的胞質動力蛋白dyneinⅠ型重鏈蛋白（DYNC1H1）的基因點突變小鼠Loa和Cra1與運動神經元變性有關；而將這些小鼠與運動神經元病SOD1突變小鼠雜交可顯著延長後者的生存時間。而我們發現，DYNC1H1基因不同位點的缺失突變Swl小鼠僅有感覺神經元的變性；同樣與SOD1突變小鼠雜交卻不能延長其生存時間。Swl、Loa與Cra1均在DYNC1H1結合區域的不同位點，因此我們推測DYNC1H1結合區功能的改變可能是導致運動或感覺神經元選擇性變性的關鍵機制。本課題通過構建含有不同Dync1h1基因突變位點的全序列質粒，擬採用基因學與蛋白組學技術探究不同DYNC1H1突變體對選擇性運動和感覺神經元生存與軸索運輸功能的影響，為進一步揭示dynein依賴的神經元變性病dyneinopathy的發病機制打下基礎。
結題摘要
運動與感覺神經元變性存在選擇性，但其分子機制尚不明確。前期我們與其他組研究發現，DYNC1H1的Swl突變雜合小鼠僅有早發的感覺神經元的變性；而同樣基因的Loa與Cra突變有早發的感覺神經元變性與晚發的運動神經元變性。我們推測，DYNC1H1結合區功能的改變可能是導致運動或感覺神經元選擇性變性的關鍵機制。前期已經成功構建分別帶有Swl、Cra、Loa突變位點的900bp~3540bp區域鹼基序列的表達質粒，通過免疫共沉澱（Co-IP）表明DYNC1H1不同突變體在293T細胞中二聚體化能力無顯著性差異，可能並不是通過影響DYNC1H1二聚體化能力導致選擇性神經元變性。本課題將不同質粒電轉入胚胎12.5天小鼠脊髓背根神經節（DRG）與胚胎18.5天皮層運動神經元，培養48小時後觀察神經元的生存數量與軸突長度。結果表明，在表達不同Dync1h1突變片段的運動神經元和感覺神經元中均出現軸突長度與存活神經元數量的差異（p＜0.05）。通過在293T細胞中過表達pcDNA3.1-FLAG-Swl、-Cra、-Loa，蛋白純化後連線於帶FLAG抗體的親和樹脂上作為“誘餌”，分別與小鼠胚胎12.5天DRG細胞裂解液混合後，Co-IP後獲得與不同DYNC1H1突變體結合“貨物”蛋白。通過QSTAR XL串聯四極桿飛行時間質譜儀檢測與iTRAQ技術定量分析與鑑定具有差異表達的蛋白。初步結果顯示，這些表達差異“貨物”蛋白大多為線粒體功能或應激相關的蛋白。以上結果表明，不同Dync1h1基因突變對運動神經元與感覺神經元的影響是不同的，可能與線粒體或應激相關的蛋白運輸障礙有關。對於不同DYNC1H1突變體在體內對運動神經元與感覺神經元功能的不同影響，我們套用CRISPR/Cas9技術在斑馬魚中對dync1h1基因進行定位編輯。表型鑑定提示，dync1h1雜合突變斑馬魚發育較野生型斑馬魚無明顯異常；而dync1h1純合突變斑馬魚胚胎正常形態發育受到嚴重抑制，脊髓腫脹，脊椎神經元數目顯著減少，背部血管存在發育畸形，並於5~6dpf死亡。這為今後在體研究不同DYNC1H1突變體在神經元選擇性變性機制中打下基礎。
