三磷酸腺苷生物發光法是一種經過簡化的生物化學方法，利用ATP與螢光素-螢光素酶複合物的反應來測定是否存在三磷酸腺苷（ATP）。該法可用於食品中微生物總數的測定。生物發光反應需要ATP、螢光素和螢火蟲螢光素酶。反應期間螢光素被氧化並發出螢光,光子的數量可採用ATP螢光儀進行測量，光子的數量的ATP含量成正比。因為每種微生物細胞中的ATP含量是恆定的，所以樣品中ATP含量與樣品中微生物的數量有關。ATP螢光儀最快能在15秒鐘內測定食品中是否存在酵母菌、黴菌或細菌細胞,靈敏度可達1個微生物/200mL (Anon 1987)。
基本介紹
- 中文名：三磷酸腺苷生物發光法
- 外文名：Adenosine triphosphate bioluminescence
- 用途：微生物總數的測定
- 反應物質：ATP、螢光素和螢火蟲螢光素酶
- 儀器：ATP螢光儀
- 時間：15秒鐘
三磷酸腺苷的理化性質,ATP生物發光法檢測的原理及一般步驟,ATP生物發光法套用範圍,
三磷酸腺苷的理化性質
（三磷酸腺苷又稱腺苷三磷酸）是高能磷酸化合物的典型代表。ATP是由一分子腺嘌呤、一分子核糖和三個相連的磷酸基團構成的核苷酸。ATP有兩個高能磷酸鍵，一個低能磷酸鍵。每個高能磷酸鍵水解時，可產生30.54kJ/mol的能量。ATP是細胞內特殊的自由能載體，廣泛地存在於細胞內，如細胞核、細胞溶膠、線粒體等。易水解，且水解時可釋放出大量的能量，但水解易受細胞內環境的PH、Mg2+濃度等的影響。ATP在生命活動中起著傳遞能量的作用。
ATP生物發光法檢測的原理及一般步驟
ATP普遍存在於所有活的生物體中，被用來貯存和傳遞化學能，稱作為“能量貨幣”。當生物體死亡後，在細胞內酶的作用下，ATP很快被分解掉。因此，測定樣品中的ATP濃度，即可推算出活菌數。
ATP生物發光技術產生於20世紀70年代中期。1983年，Moycr等最早提出細胞內源性ATP的含量可以反映細胞的活性和活細胞的數量。同年，Gronroos等也證實該技術是一種可靠、靈敏度高的確定細胞活性度的檢測方法。McElroy最先引入螢光素酶ATP檢測法。
根據文獻報導，每個細胞內的ATP含量大致是一定的，則由此可以推算出細菌數量。但由於實際檢測中除了含有細菌外，還含有酵母等其他微生物，而酵母菌中ATP的含量通常是細菌中ATP含量的100倍左右。因此，若同時又換算成酵母菌的活菌數量，則樣品中活菌數應介於二者之間。
此外，曾有學者以生物量C/ATP來推算生物量。Karl等研究了浮游植物的生物量與ATP含量之間的關係，發現單細胞微生物的生物量C/ATP的平均比值為250，而多細胞有機物的生物量C/ATP則小於100。還有學者預計通過測定ATP/CFU的大小來預測樣品中所含菌種類別，若ATP/CFU較小，則樣品中可能主要含有形態較小的G－細菌或孢子；若ATP/CFU較大，則樣品中可能主要含有酵母菌或形態較大的G+細菌。
ATP生物發光法的檢測步驟大體包括：取樣、樣品ATP萃取、添加螢光素-螢光素酶、測定生物發光量、求出ATP濃度和活菌數。通常，樣品未經處理是不能測定ATP的。測定時需先將樣品與ATP提取劑混合，使細胞膜和細胞壁溶解，釋放出ATP。ATP提取劑是以表面活性劑為基質的專用試劑。然後，提取出的ATP再與螢光素-螢光素酶生物發光劑作用，用發光檢測儀測定ATP與發光劑反應的生物發光量。通過預先測定的ATP標準曲線，得出活菌的總ATP量，即可得出細菌總數。
ATP生物發光法套用範圍
ATP生物發光法的套用範圍十分廣泛，現已套用於食品工業的眾多領域。例如，用生物發光法測定肉類食品中細菌污染情況。研究表明，ATP生物發光法與標準的細菌培養菌落計數法相比，二者具有良好的相性(r=0.98)。此外，ATP生物發光法還可用於乳製品中乳酸菌的測定、啤酒中菌落總數測定、調味品及脫水蔬菜的細菌學測定等。實驗表明，ATP生物發光法與傳統的瓊脂平板法均具有高度的相關性。食品生產環境的清潔度檢測是HACCP的重要內容。HACCP是指在食品生產和流通的整個過程中，對可能發生危害食品安全之處進行分析，確定出應重點進行衛生管理之處，並在此處設定衛生管理標準，經常進行監測，記錄下檢測結果，以防止危害健康的事件發生。以往食品生產環境的清潔度管理多採用棉拭取樣與平板培養法共用的方法來檢測表面附著的微生物，這樣就使得檢測時間長、檢測結果滯後，因而不能滿足HACCP管理系統的要求。而食物殘渣是食品生產環境的主要污染物質，且各種食品中均含有ATP，ATP耐熱性較強。因此，採用ATP生物發光法可快速、簡便地檢測出食品生產環境的清潔度。這樣，ATP生物發光法就十分適合HACCP系統的清潔度檢測。例如，用ATP生物發光法檢測食品生產線及廚房、冰櫃、食品操縱台、鐵路站車食品器具等處的清潔度。許多研究表明，這種方法與瓊脂培養法相關性高、可行有效。此外，還可以用於酵母菌等對毒素的敏感性比較。現今已出現ATP生物發光法與其它快速檢測方法並用的情況，如ATP生物發光法與PNA探針技術合用等。
